【正文】 時(shí)、菌體，特別是絲狀菌，卻因受到攪拌葉的剪切力而損傷，其受損程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于搖瓶發(fā)酵。 分分 批批 發(fā)發(fā) 酵酵 的的 優(yōu)優(yōu) 缺缺 點(diǎn)點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單，周期短，不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問題，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。 三、連續(xù)發(fā)酵 ：培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時(shí)放出含有產(chǎn)品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度、恒定的 pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長速率）下生長的發(fā)酵方式。 微生物技術(shù)應(yīng)用 11 本質(zhì)區(qū)別是以氣相還是以液相為連續(xù)相的差異，具體表現(xiàn)是固體發(fā)酵基質(zhì)中游離水的多少。 限定微生物混合固態(tài)發(fā)酵 是在對(duì)微生物相互作用和群落認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，接種混合培養(yǎng)的微生物是已知和確定的，通常使用兩種或兩種以上經(jīng)過分離純化的微生物純種，同時(shí)或先后接種同一滅過菌的培養(yǎng)基中，在無污染條件下進(jìn)行的固態(tài)發(fā)酵過程。 缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。 ： （ 1）死細(xì)胞：包括完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器。但由于試劑的毒性，易引起細(xì)胞的破壞。 基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。 乙酸對(duì)生長和表達(dá)的影響 第第 四四 章章 微微 生生 物物 發(fā)發(fā) 酵酵 產(chǎn)產(chǎn) 物物 的的 分分 離離 與與 純純 化化 第第 一一 節(jié)節(jié) 分分 離離 純純 化化 策策 略略 一一 、 建建 立立 分分 離離 純純 化化 工工 藝藝 的的 根根 據(jù)據(jù) 生生 物物 發(fā)發(fā) 酵酵 產(chǎn)產(chǎn) 物物 的的 特特 點(diǎn)點(diǎn) 理理 （（ 1）） 物物 理理 性性 質(zhì)質(zhì) （（ 2）） 化化 學(xué)學(xué) 性性 質(zhì)質(zhì) （（ 3）） 生生 物物 學(xué)學(xué) 性性 質(zhì)質(zhì) 二二 、 分分 離離 純純 化化 的的 基基 本本 過過 程程 般般 工工 藝藝 過過 程程 一一 般般 說說 來來 ， 分分 離離 純純 化化 的的 基基 本本 過過 程程 可可 分分 為為 4 個(gè)個(gè) 階階 段段 ：： 培培 養(yǎng)養(yǎng) 液液 (發(fā)發(fā) 酵酵 液液 )的的 預(yù)預(yù) 處處 理理 和和 固固 。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長快得多，這樣就會(huì)大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。但操作穩(wěn)定性差。 游游 離離 細(xì)細(xì) 胞胞 相相 比比 ， 固固 定定 化化 細(xì)細(xì) 胞胞 發(fā)發(fā) 酵酵 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) ： 固固 定定 化化 酶酶 相相 比比 ， 固固 定定 化化 細(xì)細(xì) 胞胞 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) ：： 三、固定化細(xì)胞的缺點(diǎn) 雖然固定化細(xì)胞具有上述許多優(yōu)點(diǎn)，但也有不足之處，具體表現(xiàn)在： ； 、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用； 微生物技術(shù)應(yīng)用 12 ； 。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。 強(qiáng)化微生物混合固態(tài)發(fā)酵 是指在自然富集固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上，根據(jù)人們部分掌握的微生物代謝機(jī)制，人為強(qiáng)化接種微生物菌系不明確的富集培養(yǎng)物或特定微生物培養(yǎng)物 所進(jìn)行的混合發(fā)酵過程。從這個(gè)定義中可以充分認(rèn)識(shí)固態(tài)發(fā)酵的特點(diǎn)，以及與液態(tài)發(fā)酵本質(zhì)的區(qū)別。 補(bǔ)料 — 分批發(fā)酵的缺點(diǎn) 由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降 。微 生物生長分為：遲滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和死亡期。發(fā)酵罐發(fā)酵是處于正壓狀態(tài)，而搖瓶基本上處于常壓狀態(tài)，所以罐中培養(yǎng)液的 CO2 濃度明顯大于搖瓶，而 CO2 對(duì)細(xì)胞呼吸和某些微生物代謝產(chǎn)物的生物合成有著較大的影響。 控制參數(shù)： 1．溫度 2． pH 值 3．氧 攪拌 發(fā)酵中判斷放罐的大要指標(biāo)： 有產(chǎn)物濃度、過濾速度、氨基氮、菌絲形態(tài)、 pH、發(fā)酵液的外觀及黏度等；一般菌絲自溶前總有跡象，如氨基氮開始升高、 pH 上升、菌絲碎片增多、黏度增加、過濾速度降低等，其中最后一項(xiàng)對(duì)染菌罐尤為重要。 離心場作用：顆粒及其微生物沉降 ? 直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆粒。 加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。 相對(duì)熱阻： 指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。 （ 2）物理滅菌 各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進(jìn)行滅菌。 3 培養(yǎng)基滅 菌： 是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。 產(chǎn)物促進(jìn)劑 ： 是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的 添加劑。 優(yōu)點(diǎn)： 來源廣泛、價(jià)格底；難利用，可以解除葡萄糖效應(yīng)。前者利用可選擇的遺傳表型和功能如抗藥性、藍(lán)白斑、噬菌斑等可以直觀、快速的在大量群體中進(jìn)行篩選；后者根據(jù)目的基因的大小、核苷酸序列、基因表達(dá)產(chǎn)物的特性，用限制性酶切、分子雜交、核苷酸序列分析及表達(dá)產(chǎn)物分析。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA 的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使 DNA 導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。 載體必 須具備下列幾個(gè)條件 : ①是一個(gè)有自我復(fù)制能力的復(fù)制子 。 2．原生質(zhì)體制備。 2 原生質(zhì)體融合： 是最近幾十年發(fā)展起來的基因重組技術(shù)， 通過兩個(gè)遺傳性狀不同的親株原生質(zhì)體融合而達(dá)到雜交目的 。營養(yǎng)缺陷型或抗性突變等的性狀就象一個(gè) 高效分離的 “ 篩子 ” ，以它們?yōu)楹Y選的條件，可以大大加快篩選的進(jìn)程并有效地防止漏篩。當(dāng)然， 這種鑒別方法只能用于初篩。 （ 1）誘變劑的選擇 在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。 物物 理理 誘誘 變變 劑劑 中中 目目 前前 使使 用用 得得 最最 方方 便便 而而 且且 十十 分分 有有 效效 的的 是是 紫紫 外外 線線 。 自自 然然 狀狀 態(tài)態(tài) 下下 ， 堿堿 基基 對(duì)對(duì) 發(fā)發(fā) 生生 自自 然然 突突 變變的的 機(jī)機(jī) 率率 僅僅 為為 108～～ 109， 出出 現(xiàn)現(xiàn) 優(yōu)優(yōu) 良良 性性 狀狀 的的 可可 能能 較較 小小 ， 需需 堅(jiān)堅(jiān) 持持 相相 當(dāng)當(dāng) 長長 的的 時(shí)時(shí) 間間 才才 能能 收收 到到 效效 果果 。該法可分離到許多放線菌。 分離放線菌時(shí)，在樣 品懸浮液中加入 10 滴 10%的酚或加青霉素（抑制 G+菌）、鏈霉素（抑制 G菌）各30～ 50U/ml，以及丙酸鈉 10μ g/ml（抑制霉菌類）抑制霉菌和細(xì)菌的生長。 如細(xì)菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿（ ～ ），霉菌和酵母菌要求偏酸（ ～ 6）。 5 生產(chǎn)性能測定： 進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。放線菌實(shí)際上是屬于 細(xì)細(xì) 菌菌 范范 疇疇 內(nèi)的 原原 核核 微微 生生 物物 ，只不過其細(xì)胞形態(tài)為 分分 枝枝 狀狀 菌菌 絲絲 。 第 2 章 微生物資源開發(fā)與菌株選育 第一節(jié) 常用微生物的類群 一、 工業(yè)化菌種應(yīng)符合下述要求： 能夠利用廉價(jià)的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物 有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強(qiáng) 遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定 不易感染它種微生物或噬菌體 產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)） 生產(chǎn)特性要符合工藝要求 二、 工業(yè)上重要細(xì)菌 埃希氏大腸菌 醋酸桿菌 假單胞菌 短桿菌 棒狀桿菌 乳酸桿菌 雙歧桿菌 丙酸桿菌 枯草芽孢桿菌 鏈孢囊菌屬 芽孢梭菌 鏈球菌 三、 放線菌 1 概念： 放線菌（ Actinomyces）是 指在形態(tài)上具有 分分 枝枝 狀狀 菌菌 絲絲 、 菌菌 落落 形形 態(tài)態(tài) 與 霉霉 菌菌 相相 似似 ，以 孢孢 子子 進(jìn)行 繁繁 殖殖 的原核微生物。 4 分離： 利用分離技術(shù)得到純種。 2 控制培養(yǎng)條件： 在篩選某些微生物時(shí)，除通過培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇外，還可通過它們對(duì) pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達(dá)到有效的分離目的。 篩選霉菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素等抗生素抑制細(xì)菌，使霉菌在樣品的比例提高，從中便于分離到所需的菌株。 孢子飛揚(yáng)法 ：是將土樣置于一種瓶口剛好能倒扣一個(gè)分離平版的特制瓶中，距離振蕩使孢子飛揚(yáng)，撞在分離平板上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。 一一 般般 習(xí)習(xí) 慣慣 上上 將將 自自 然然 選選 育育 稱稱 為為 菌菌 種種 的的 分分 離離 純純 化化 。 誘誘 變變 劑劑 ：： 能能 夠夠 提提 高高 生生 物物 體體 突突 變變 頻頻 率率 的的 物物 質(zhì)質(zhì) 稱稱 為為 誘誘 變變 劑劑 。 出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選 2～ 3 株 ，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。盡管相當(dāng)多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。 特殊變異菌株的篩選方法： 特殊變異菌株，如 營養(yǎng)缺陷型、抗性突變菌株、溫度敏感突變株、組成型突變株 等。這種方法適用范圍很廣，在酒類、面包、藥用和飼料酵母的育種，鏈霉菌和青霉菌抗生素產(chǎn)量的提高，曲霉的酶活性增強(qiáng)等方面均已獲得成功。 原生質(zhì)體