【正文】 微生物技術(shù)應(yīng)用 2 1 真菌 ：具有細(xì)胞壁，不含葉綠素，無根莖葉的分化，以產(chǎn)生大量孢子進行繁殖，以寄生或腐生方式生存的真核微生物。 微生物技術(shù)應(yīng)用 11 章緒論 微生物技術(shù)的概念： 所有直接或間接的利用微生物、微生物的機能、微生物的組成部分或其代謝產(chǎn)物（如酶）來加工生產(chǎn)產(chǎn)品，或為社會提供服務(wù)的技術(shù)。 2 工業(yè)上重要真菌 ： 酵母菌 、 霉菌 、 蕈菌 五、 極端微生物 極端微生物（ extremophiles），也叫極端環(huán)境微生物，是最適合生活在極端環(huán)境中的微生物的總稱，包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿、嗜壓、嗜鹽、抗輻射、耐干燥和極端厭氧等多種類型 嗜熱菌的最著名的產(chǎn)品： Taq酶 第二節(jié) 菌株的分離與篩選 一、 新種分離與 篩選的一般步驟： 1 定方案： 首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性，設(shè)計合理的篩選方案。 采土方式 —— 在選好適當(dāng)?shù)攸c后，除去表土，取離地面 515cm 處的土約 10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。 從土壤中分離芽孢桿菌時，由于芽孢具有耐高溫特性， 100℃很難殺死，要在 121℃才能徹底死亡。具體方法是：取風(fēng)干并破碎的土樣 1g，加如無菌水 10mL，劇烈震搖 1min，然后靜置 1min，使粗砂粒沉淀，吸取上面的懸浮液 1mL，用無菌水進行系列梯度稀釋，取適當(dāng)濃度的稀釋液 ，涂布于分離平板上培養(yǎng)。以熱穩(wěn)定蛋白酶產(chǎn)生菌篩選為例：將選出的菌落接液體試管進行微量培養(yǎng)，以對硝基苯胺短肽衍生 物為反應(yīng)底物，在 96 孔板中 65℃下反應(yīng) 10min 和 40min，分別用微孔讀板儀測定酶活，然后用兩種酶活的比值作圖來代表酶的熱穩(wěn)定性，選出熱穩(wěn)定性高的菌株。 7H2O g ， 加水1000 ml 。 大大 部部 分分 誘誘 變變 劑劑 是是 致致 癌癌 劑劑 ， 所所 以以 在在 使使 用用 中中 必必 須須 非非 常常 謹(jǐn)謹(jǐn) 慎慎 ， 要要 避避 免免 化化 學(xué)學(xué) 誘誘 變變 劑劑 與與 皮皮 膚膚 接接 觸觸 ， 且且 切切 勿勿 吸吸 入入 其其蒸蒸 氣氣 （（ 三三 ）） 誘誘 變變 育育 種種 的的 一一 般般 步步 驟驟 ：： 誘誘 變變 育育 種種 包包 括括 出出 發(fā)發(fā) 菌菌 種種 選選 擇擇 、 誘誘 變變 處處 理理 和和 篩篩 選選 突突 變變 株株 三三 個個 部部 分分 。 初篩的目的： 刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 C 搖瓶培養(yǎng)法： 是 將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后 ，再對培養(yǎng)液進行分析測定 。 通過這種方法可以分離到 具有新的基因組合的重組體 ，也可以選出由于具有雜種優(yōu)勢而生長旺盛、生物量多、適應(yīng)性強以及某些酶活性提高的 新品系 。 原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)點： 雜交頻率較高 鏈霉菌通過原生質(zhì)體融合，后代的重組率達(dá) 1%，比準(zhǔn)性重組率高 2020200 倍。 6．生產(chǎn)性能篩選。 在分子克隆中最有用的的 DNA 連接酶是來自 T4 噬菌體的 DNA 連接酶。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在 DNA 連接酶作用下使噬菌體 DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。 ： 滿足菌體的生長 促進產(chǎn)物的形成 （ 1）碳源 作用 提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分；提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分。 無機氮源 無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種 經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫 生理酸性物質(zhì) ，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為 生理堿性物質(zhì) ，如硝酸鈉。 ③ 培養(yǎng)基的原料應(yīng)因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能 微生物技術(shù)應(yīng)用 8 保證生產(chǎn)上的供應(yīng)。 5 滅菌的方法、原理 （ 1）化學(xué)滅菌： 用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。當(dāng)溫度超過最高限度時，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時間內(nèi)死亡， 加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進行的。 缺點：加熱和冷卻時間較長。 靜電除菌 ：通過高壓電流場，帶電粒子被吸附。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。發(fā)酵罐中的 K d 值一般都大于搖瓶。 發(fā)酵罐規(guī)模改變的影響 發(fā)酵罐規(guī)模的變化，導(dǎo)致很多物理和生物參數(shù)的改變。 二、補料 分批發(fā)酵 定義： 又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點。 ： 菌種發(fā)生變異的可能性較大； 長時間補料染菌機會大大增 加，要求嚴(yán)格的無菌條件。 （ 1）傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵與現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵 依據(jù)固態(tài)發(fā)酵過程中是否能實現(xiàn)限定微生物純種培養(yǎng)，分為傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵與現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵。這嚴(yán)重地阻礙了混合菌培養(yǎng)的發(fā)展和應(yīng)用。 （四）共價交聯(lián)法 借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。 （ 2）活細(xì)胞：包括增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、饑餓細(xì)胞。 包埋法：細(xì)胞和 載體間沒有束縛，固定化后，細(xì)胞仍保持較高活力。 基因工程菌生長與表達(dá)的影響因素 溶氧濃度對工程菌發(fā)酵的影響 通過增大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。 誘導(dǎo)時間對外源蛋白表達(dá)的影響 誘導(dǎo)時間：加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時間 隨著誘導(dǎo)時間的延長，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。 第三節(jié) 基因工程菌的發(fā)酵 何謂基因工程 基因工程 （ geic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。 五、細(xì)胞固定化的方法 細(xì)胞固定化方法有：吸附、共價結(jié)合、交聯(lián)、包埋、微膠囊。 酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子 區(qū)別： （ a）共價交聯(lián)：酶分子之間 用用 雙雙 功功 能能 基基 團團 的的 化化 學(xué)學(xué) 交交 聯(lián)聯(lián) 試試 劑劑 相相 互互 交交 聯(lián)聯(lián) 成水不溶性的固定化酶； （ b）共價偶聯(lián)：酶分子 被被 偶偶 聯(lián)聯(lián) 到到 水水 不不 溶溶 性性 載載 體體 上上 形形 成成 水不溶性的固定化酶 固定化細(xì)胞 一、定義 ：是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理 化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具備能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。它對于擴大固態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用范圍和潛力的發(fā)揮起到非常重要作用，同時，也是固態(tài)發(fā)酵一個重要方向。 自然富集固態(tài)發(fā)酵 是指利用自然界中的微生物，由不斷演替的微生物進行的富集混合發(fā)酵過程。 四、固態(tài)發(fā)酵 ： 是指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物發(fā)酵的一個生物反應(yīng)過程。在工廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多。 第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵的方式 一、分批發(fā)酵 分批發(fā)酵定義： 是指在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式。特別是對溶氧要求高而又敏感的菌株，在罐中發(fā)酵的生產(chǎn)能力可能比在搖瓶中高，并隨 K Lα 和溶解氧水平升高而升高。 ③固態(tài)法培養(yǎng) ：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培養(yǎng)皿等麩皮培養(yǎng)。發(fā)酵工業(yè)采用。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。 致死時間 ： 在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。 機理： 蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞 細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 與與 發(fā)發(fā) 酵酵 設(shè)設(shè) 備備 的的 滅滅 菌菌 1 雜菌： 除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。 氮源使用的一些相關(guān)問題： 有機氮源和無機氮源應(yīng)當(dāng)混合使用 早期：容易利用易同化的氮源 — 無機氮源 中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì) 有些產(chǎn)物會受氮源的誘導(dǎo)和阻遏 有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力 開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣的課題 （ 3）無機鹽的微 量元素 使用注意點： 必須加以考慮； B、使用時注意鹽的形式（ pH 的變化） （ 4）生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑 生長因子： 凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。 糖蜜使用的注