【正文】 因而每次試驗，常需同時接種多管。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。1176。C培養(yǎng)4天、176。４、甲基紅（Methyl Red）試驗　　腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使甲基紅指示劑變紅。隨酸度而增強黃色，則隨堿度而增強黃色，可能變色不夠明顯，此時應延長培養(yǎng)時間，重復試驗。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。明膠高層亦可培養(yǎng)于36177。1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?！　≡囼灧椒ǎ涸诤辛虼蛩徕c等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36177?！　”驹囼灴赏瑫r觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。在食品微生物檢驗中，常用血清學反應來鑒定分離到的細菌，以最終確認檢測結(jié)果。而且，在第二階段反應中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學反應的結(jié)果。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。如肥達氏反應就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過剩，故應稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價。單向擴散是一種定量試驗。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結(jié)合。為了避免沒有合適的取樣工具，建議建立一個無菌取樣的分析清單，來收集取樣工具。墻壁、頂部管道和檢驗中考察的其他潛在污染源程序，并且記錄可能的聯(lián)系，在環(huán)境樣品來源和食物產(chǎn)品的污染方面，可以使樣品具有意義，并且是提倡這樣做的，例如：　　地面噴濺水：工人從有地面污水的地方走過后又回到加工區(qū)域嗎？　　墻壁：墻壁上面和在制品上面有昆害蟲嗎？　　天花板：冷凝物或噴漆有無掉落到產(chǎn)品上或被發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)品相接觸？4．某些準備干冰：（有的稱為gel backs）　　如果使樣品在貯運過程中保持冷卻，一些種類的制冷劑是必需的。　　無菌棉拭子：　　一般用于拭取儀器設(shè)施和工廠環(huán)境區(qū)域，使用棉拭子一般有一個正確的程序，打開棉拭子剝掉表皮，然后必須小心的放在試管頭上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取樣的部位，象案板頭或頂部管道，然后從試管頭上小心翼翼地將拭子放入——將其全部堆入直到試管中部。目前最為流行的抽樣方案為ICMSF推薦的抽樣方案和隨機抽樣方案，有時也可參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。目前，加拿大、以色列等很多國家已采用此法作為國家標準。二級法只設(shè)有n、с及m值，三級法則有n、c、m及M值。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格?！　CMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理條件三者綜合在一起進行食品中微生物危害度分類的。在1015例用二級法則不得檢出該致病菌c=0?！　榱税踩鋬錾r加熱吃，減少危害度適用例10。查看該數(shù)字所在的行和列。抽樣必須遵循無菌操作程序，抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應當高壓滅菌，防止一切可能的外來污染。4．統(tǒng)裝或大容器包裝的冷凍食品　　（1）．對大塊冷凍食品，應從幾個不同部位用滅菌工具抽樣，使之有充分的代表性。　?。?）當樣品需要托運或由非專職抽樣人員運送時，必須封識樣品容器。在標記上應記明產(chǎn)品標志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況。盡可能不用水銀溫度計測量，以防溫度計破碎后水銀污染食品；　?。?）．如為非冷藏易腐食品，應迅速將所抽樣品冷卻至04℃。當遇到所查數(shù)超過最大編號數(shù)量（如第50行的第11和12列的數(shù)字為93大于600）則舍去此數(shù)，繼續(xù)查下一行相同列數(shù)，直到完成應抽樣品件數(shù)為止。如將一批600包的產(chǎn)品編為2……600?！　CMSF方法是以二級法、三級法和抽樣的概念為基礎(chǔ)，再將微生物的知識加進來，則可以提出各種食品的微生物標準。　　根據(jù)上表15種情況的舉例，13可用三級法，45可用二級法來判定是否合格?！　。?）．ICMSF對食品中微生物的危害度分類與抽樣方案說明　　為了強調(diào)抽樣與檢樣之間的關(guān)系，ICMSF已經(jīng)闡述了把嚴格的抽樣計劃與食品危害程度相聯(lián)系的概念（ICMSF，1986）。　?。?）三級抽樣方案。ICMSF方法與此不同，它是從統(tǒng)計學原理來考慮，對一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的。因此在選擇抽樣方案之前，必須考慮諸多因素（ICMSF，1986），包括：　　——檢驗目的　　——產(chǎn)品及被抽樣品的性質(zhì)　　——分析方法　　ICMSF提出的采樣基本原則，是根據(jù)（1）各種微生物本身對人的危害程度各有不同。要保證樣品的代表性首先要有一套科學的抽樣方案，其次使用正確的抽樣技術(shù)，并在樣品的保存和運輸過程中保持樣品的原有狀態(tài)。　　滅菌手套：　　滅菌手套在采樣中并非必須啟用，如果一個產(chǎn)品在樣品收集過程中必須被接觸，那么最好讓工廠生產(chǎn)線的工人來做（加工處理產(chǎn)品的工人），將樣品放入收集容器中，既然工人在生產(chǎn)過程中處理接觸產(chǎn)品，那么我們就不能認為他們對產(chǎn)品又有附加的污染?！　∩a(chǎn)線樣品的采集一般用來確定細菌污染源是否來自于原材料或加工序中的某些地方。一、檢驗前的準備工作：1．包裝無菌取樣的工具：　　擁有正確的采取產(chǎn)品或加工過程的無菌取樣器械工具是至關(guān)重要的的。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的復合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與細菌及相應抗體復合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。２、沉淀反應　　可溶性抗原與相應抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應（Precipitation）。多用已知抗原來檢測血清中有無相應抗體及其含量?！　?。第二階段為抗原體反應的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補體結(jié)合反應等?！　”驹囼炗糜谀c桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。1三糖鐵（TSI）瓊脂試驗　　試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36177。應在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗結(jié)果。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。　　試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基?！　嶒炞C明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果?！　”驹囼炓话阌糜谀c桿菌科各菌屬的鑒別?！　。玻〣arritt氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36177。３、VP試驗　　某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。C培養(yǎng)24~48h，或于20176。176。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。　?。荷顚右后w培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣?！　　　∵@類菌是需要氧氣的。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當?shù)乃只钚詤^(qū)域。也會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。三、培養(yǎng)　　微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。（圖３－５，a）圖３－５　傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解 ２、涂布平板法　　首先把微生物懸液通過適當?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應盡量減少，其周圍雜菌也應越少越好。　?。罚┳⑸浣臃N 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。（圖３－３）　圖３－３　接種和分離工具1．接種針 　　　　　常用的接種方法有以下幾種：　?。保﹦澗€接種 這是最常用的接種方法。培養(yǎng)基的保存　　培養(yǎng)基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)?！　…傊泵媾囵B(yǎng)基應在滅菌后立即取出，冷至55℃60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。每批培養(yǎng)基應另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121176。PH調(diào)整后，還應將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項 １、培養(yǎng)基配方的選定　　同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當時間后再用清水洗凈。常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學成分?！　?。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。C。C恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體?！　。褐苯訉⒁镜奈锲贩湃肭逅校蠓?5分鐘，即可殺死細菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。C，恒溫1小時即可?！　∪旧慕Y(jié)果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。　　革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：　?。保┩科潭āＳ醒堪臈U菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負反應?！　稳旧话阋?jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。故亦稱鑒別染色法。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復紅最后進行染色，就是復染。染色的時間各不相同，視標本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱?！　。玻┍ＷC菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。堿性染料　　這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。 二、染料的種類和選擇　　染料分為天然染料和人工染料兩種。如酸性物質(zhì)細胞核對于堿性染料就有化學親和力，易于吸附。2516計數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)染色技術(shù) 　　由于微生物細胞含有大量水分（一般在8090%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差?！　⊙蛴嫈?shù)器是一只特制載玻片。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。用過油浸鏡的，應先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。載玻片標本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。高倍鏡觀察　　顯微鏡的設(shè)計一般是共焦點的。圖３－１　光學顯微鏡結(jié)構(gòu)圖：　　顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。聚光鏡能使光線照射標本后進入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱，因而對提高物鏡分辨率是很重要的。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。　　使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動?！　＄R頭的保護最為重要。轉(zhuǎn)動目鏡，如果視野中可以看到污點隨著轉(zhuǎn)動，則說明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。另一種是一個大方格分25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（2516或1625）400個小方格。染色后的微生物標本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細胞的真實情況，染色觀察時必須注意?！　〖毦牡入婞c較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。單純?nèi)玖稀　∵@類染料的化學親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。　　以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應用較多普遍，但是應當指出，在研究微生物細胞結(jié)構(gòu)時不適用，應采用化學固定法。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進行。９、鏡檢　　干燥后的標本可用顯微鏡觀察。１、單染色法　　用一種染色劑對涂片進行染色，簡便易行，適于進行微生物的形態(tài)觀察?！　〔菟徜@結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。　　另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸