【正文】 因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。1176。C培養(yǎng)4天、176。４、甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)　　腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使甲基紅指示劑變紅。隨酸度而增強(qiáng)黃色，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。明膠高層亦可培養(yǎng)于36177。1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?！　≡囼?yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36177。　　本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。原理是用已知抗體來(lái)檢測(cè)未知抗原。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過(guò)剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)。其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。為了避免沒(méi)有合適的取樣工具，建議建立一個(gè)無(wú)菌取樣的分析清單，來(lái)收集取樣工具。墻壁、頂部管道和檢驗(yàn)中考察的其他潛在污染源程序，并且記錄可能的聯(lián)系，在環(huán)境樣品來(lái)源和食物產(chǎn)品的污染方面，可以使樣品具有意義，并且是提倡這樣做的，例如：　　地面噴濺水：工人從有地面污水的地方走過(guò)后又回到加工區(qū)域嗎？　　墻壁：墻壁上面和在制品上面有昆害蟲嗎？　　天花板：冷凝物或噴漆有無(wú)掉落到產(chǎn)品上或被發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)品相接觸？4．某些準(zhǔn)備干冰：（有的稱為gel backs）　　如果使樣品在貯運(yùn)過(guò)程中保持冷卻，一些種類的制冷劑是必需的?！　o(wú)菌棉拭子：　　一般用于拭取儀器設(shè)施和工廠環(huán)境區(qū)域，使用棉拭子一般有一個(gè)正確的程序，打開棉拭子剝掉表皮，然后必須小心的放在試管頭上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取樣的部位，象案板頭或頂部管道，然后從試管頭上小心翼翼地將拭子放入——將其全部堆入直到試管中部。目前最為流行的抽樣方案為ICMSF推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方案，有時(shí)也可參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn)抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。目前，加拿大、以色列等很多國(guó)家已采用此法作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。二級(jí)法只設(shè)有n、с及m值，三級(jí)法則有n、c、m及M值。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過(guò)M值者，則為不合格?！　CMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理?xiàng)l件三者綜合在一起進(jìn)行食品中微生物危害度分類的。在1015例用二級(jí)法則不得檢出該致病菌c=0?！　榱税踩?，冷凍生蝦加熱吃，減少危害度適用例10。查看該數(shù)字所在的行和列。抽樣必須遵循無(wú)菌操作程序，抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)高壓滅菌，防止一切可能的外來(lái)污染。4．統(tǒng)裝或大容器包裝的冷凍食品　?。?）．對(duì)大塊冷凍食品，應(yīng)從幾個(gè)不同部位用滅菌工具抽樣，使之有充分的代表性?！　。?）當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽樣人員運(yùn)送時(shí)，必須封識(shí)樣品容器。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號(hào)碼和樣品順序號(hào)以及其他需要說(shuō)明的情況。盡可能不用水銀溫度計(jì)測(cè)量，以防溫度計(jì)破碎后水銀污染食品；　?。?）．如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所抽樣品冷卻至04℃。當(dāng)遇到所查數(shù)超過(guò)最大編號(hào)數(shù)量（如第50行的第11和12列的數(shù)字為93大于600）則舍去此數(shù)，繼續(xù)查下一行相同列數(shù)，直到完成應(yīng)抽樣品件數(shù)為止。如將一批600包的產(chǎn)品編為2……600?！　CMSF方法是以二級(jí)法、三級(jí)法和抽樣的概念為基礎(chǔ)，再將微生物的知識(shí)加進(jìn)來(lái)，則可以提出各種食品的微生物標(biāo)準(zhǔn)?！　「鶕?jù)上表15種情況的舉例，13可用三級(jí)法，45可用二級(jí)法來(lái)判定是否合格。　?。?）．ICMSF對(duì)食品中微生物的危害度分類與抽樣方案說(shuō)明　　為了強(qiáng)調(diào)抽樣與檢樣之間的關(guān)系，ICMSF已經(jīng)闡述了把嚴(yán)格的抽樣計(jì)劃與食品危害程度相聯(lián)系的概念（ICMSF，1986）?！　。?）三級(jí)抽樣方案。ICMSF方法與此不同，它是從統(tǒng)計(jì)學(xué)原理來(lái)考慮，對(duì)一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的。因此在選擇抽樣方案之前，必須考慮諸多因素（ICMSF，1986），包括：　　——檢驗(yàn)?zāi)康摹　　a(chǎn)品及被抽樣品的性質(zhì)　　——分析方法　　ICMSF提出的采樣基本原則，是根據(jù)（1）各種微生物本身對(duì)人的危害程度各有不同。要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的抽樣方案，其次使用正確的抽樣技術(shù)，并在樣品的保存和運(yùn)輸過(guò)程中保持樣品的原有狀態(tài)。　　滅菌手套：　　滅菌手套在采樣中并非必須啟用，如果一個(gè)產(chǎn)品在樣品收集過(guò)程中必須被接觸，那么最好讓工廠生產(chǎn)線的工人來(lái)做（加工處理產(chǎn)品的工人），將樣品放入收集容器中，既然工人在生產(chǎn)過(guò)程中處理接觸產(chǎn)品，那么我們就不能認(rèn)為他們對(duì)產(chǎn)品又有附加的污染?！　∩a(chǎn)線樣品的采集一般用來(lái)確定細(xì)菌污染源是否來(lái)自于原材料或加工序中的某些地方。一、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：1．包裝無(wú)菌取樣的工具：　　擁有正確的采取產(chǎn)品或加工過(guò)程的無(wú)菌取樣器械工具是至關(guān)重要的的。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。有幾對(duì)抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。２、沉淀反應(yīng)　　可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（Precipitation）。多用已知抗原來(lái)檢測(cè)血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其含量?！　?。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。　　本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。1三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)　　試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36177。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，?xì)菌均能合成此酶?！　≡囼?yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基?！　?shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。迄至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果?！　”驹囼?yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別?！　。玻〣arritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36177。３、VP試驗(yàn)　　某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。C培養(yǎng)24~48h，或于20176。176。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定?！　。荷顚右后w培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣?！　　　∵@類菌是需要氧氣的。各種微生物在不能生長(zhǎng)發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。也會(huì)死亡。這是因?yàn)槌松L(zhǎng)需要能量以外，細(xì)菌還需要能量來(lái)維持它的生存。三、培養(yǎng)　　微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落。（圖３－５，a）圖３－５　傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解 ２、涂布平板法　　首先把微生物懸液通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂專∫欢康南♂屢悍旁跓o(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò)。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，空氣流動(dòng)應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周圍雜菌也應(yīng)越少越好?！　。罚┳⑸浣臃N 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。（圖３－３）　圖３－３　接種和分離工具1．接種針 　　　　　常用的接種方法有以下幾種：　?。保﹦澗€接種 這是最常用的接種方法。培養(yǎng)基的保存　　培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)?！　…傊泵媾囵B(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55℃60℃時(shí)，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，以為測(cè)定該批培養(yǎng)基最終pH之用。C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶?jī)?nèi)，裝入量不得超過(guò)燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個(gè)雞蛋的蛋白，強(qiáng)力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121176。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng) １、培養(yǎng)基配方的選定　　同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會(huì)有某些差別。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來(lái)觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來(lái)保藏菌種。２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時(shí)間后再用清水洗凈。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來(lái)蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。它的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分?！　　?duì)同種微生物來(lái)講，幼齡菌比老齡菌對(duì)熱更敏感。C。C恒溫箱中過(guò)夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體?！　。褐苯訉⒁镜奈锲贩湃肭逅?，煮沸15分鐘，即可殺死細(xì)菌的全部營(yíng)養(yǎng)和部分芽孢。C，恒溫1小時(shí)即可?！　∪旧慕Y(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色?！　「锾m氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：　　１）涂片固定。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)?！　稳旧话阋?jīng)過(guò)涂片、固定、染色、水洗和干燥五個(gè)步驟。故亦稱鑒別染色法。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。染色的時(shí)間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時(shí)染色時(shí)還要加熱。　?。玻┍ＷC菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。堿性染料　　這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。 二、染料的種類和選擇　　染料分為天然染料和人工染料兩種。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對(duì)于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。2516計(jì)數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)染色技術(shù) 　　由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在8090%以上），對(duì)光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒(méi)有明顯的明暗差?！　⊙蛴?jì)數(shù)器是一只特制載玻片。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。用過(guò)油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過(guò)低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。高倍鏡觀察　　顯微鏡的設(shè)計(jì)一般是共焦點(diǎn)的。圖３－１　光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖：　　顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長(zhǎng)短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長(zhǎng)或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長(zhǎng)短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。顯微鏡的種類很多，在實(shí)驗(yàn)室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進(jìn)入物鏡，形成一個(gè)大角度的錐形光柱，因而對(duì)提高物鏡分辨率是很重要的。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度?！　∈褂糜徒R時(shí)，鏡臺(tái)要保持水平，防止油流動(dòng)?！　＄R頭的保護(hù)最為重要。轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，如果視野中可以看到污點(diǎn)隨著轉(zhuǎn)動(dòng)，則說(shuō)明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。另一種是一個(gè)大方格分25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，不論哪一種，一個(gè)大方格，都等分成（2516或1625）400個(gè)小方格。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過(guò)程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意?！　〖?xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶陽(yáng)電。多數(shù)染料為帶色的有機(jī)酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑中。單純?nèi)玖稀　∵@類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因?yàn)樗鼈兇蠖鄶?shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料?！　∫陨线@種固定法在微生物實(shí)驗(yàn)室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時(shí)進(jìn)行。９、鏡檢　　干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。１、單染色法　　用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡(jiǎn)便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察?！　〔菟徜@結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色?！　×硗猓?yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸