【正文】 經(jīng)國家新藥評(píng)審中心評(píng)審?fù)膺M(jìn)入臨床試驗(yàn)（臨床批件號(hào)：2003L02511），“蠶表達(dá)基因工程生白細(xì)胞藥物的方法”已獲得國家發(fā)明專利（專利號(hào)：）,相關(guān)研究成果發(fā)表在Eur. J. Pharm. 。相關(guān)研究成果擬發(fā)表在PLoS One。經(jīng)檢測(cè)，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的受體結(jié)合特性以及CTB和胰島素的抗原性。進(jìn)一步分析得知，新蛋白N端增加的兩個(gè)氨基酸并未顯著影響其與神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）的結(jié)合能力。本研究表明口服家蠶表達(dá)的CTB與人胰島素B鏈融合蛋白可以作為一種口服蛋白疫苗，并對(duì)NOD模型鼠的胰島炎癥具有很好的抑制作用。采取灌喂法，連續(xù)給藥10天后，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。通過灌胃的方式，對(duì)小鼠進(jìn)行了降血鈣和骨保護(hù)的口服研究。相關(guān)研究成果發(fā)表在Avian Biochim. Biophys. 。通過低溫冷凍干燥及劑型的研制，研制了rhEPO膠囊(康血寶)。人工合成含有桿狀病毒gp64信號(hào)肽、跨膜區(qū)與A/Zhejiang/16/06(H5N1)毒株的HA基因的融合基因，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAKgp64HA，與線性化的野生型桿狀病毒BacPAK6共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，經(jīng)過多輪篩選，獲得表達(dá)HA蛋白的重組桿狀病毒Bmgp64HA。免疫及攻毒后，各組試驗(yàn)動(dòng)物的血生化、血常規(guī)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。（b）禽流感疫苗對(duì)心血管、呼吸系統(tǒng)及體溫的影響猴心血管及呼吸系統(tǒng)試驗(yàn)表明：、對(duì)猴心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯影響，其血壓、呼吸頻率、呼吸幅度和心電各指標(biāo)均與給藥前相似（P）；對(duì)猴體溫也無明顯影響，其各測(cè)量時(shí)間段的平均體溫與給藥前相似（P），也與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組相似（P）。 mg/kg。結(jié)果顯示：禽流感疫苗對(duì)豚鼠過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。經(jīng)過2D電泳分離后，進(jìn)行酶解，質(zhì)譜分析，目標(biāo)蛋白中80%以上為膜蛋白。另外，可以通過特定細(xì)胞或組織培養(yǎng)的方式，獲得特定細(xì)胞或組織的細(xì)胞膜蛋白，對(duì)藥物開發(fā)具有十分重要的意義。我們利用BmBacPAKph表達(dá)膜蛋白，膜蛋白與多角體蛋白融合形成結(jié)晶，表達(dá)量達(dá)到14mg/蛹（2g）(如圖1所示)。生物信息學(xué)分析推測(cè)BmCRABP可能與RA的降解有關(guān)，因此我們研究了BmCRABP和全反式維甲酸(alltrans retinoic acid, atRA)的關(guān)系。（c）兩種家蠶1433蛋白的表達(dá)分析及其亞細(xì)胞定位通過家蠶蛹cDNA文庫的構(gòu)建獲得家蠶1433ε和1433ζ基因,我們表達(dá)并制備了該基因的多克隆抗體。我們獲得并表達(dá)了家蠶TnC基因，制備的相應(yīng)抗體效價(jià)可達(dá)到1：25600以上。我們獲得并表達(dá)了家蠶profilin基因BmPFN，制備的多克隆抗體效價(jià)為1:32000。Western印跡分析呈陽性并發(fā)現(xiàn)在蠶蛹中也有特異性條帶，分子量為20kD左右，證實(shí)了重組蛋白的表達(dá)。將爬片的Bm5細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BmSPI表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞核中幾乎沒有?，F(xiàn)有的2DE的上樣方式主要有水化上樣（混合上樣）和杯上樣兩種。為了獲得更多的家蠶卵蛋白，我們開發(fā)了一種新的家蠶卵蛋白樣品制備方法。我們進(jìn)行了家蠶有性生殖和孤雌生殖的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。（b）家蠶Yellow基因家族的鑒定和分析研究表明，Yellow蛋白家族在蜜蜂和果蠅的發(fā)育過程中呈現(xiàn)重要的生理和生化功能，該蛋白家族成員都包含一個(gè)MRJP保守域。本研究中我們通過質(zhì)譜鑒定了家蠶ORF庫和cDNA序列虛擬ORF庫。(3) 家蠶RNA相關(guān)研究（a）家蠶microRNA的鑒定與功能研究microRNA(miRNA)是一類能調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，目前為止，在家蠶中只有l(wèi)et7 通過Northern blotting得到驗(yàn)證。我們通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了1671個(gè)家蠶基因mRNA的3’UTR中存在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)547個(gè)基因存在986個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)化分析表明，DNA水平的G to A 突變可能被轉(zhuǎn)錄后修飾的A to I RNA編輯校正，編輯得到的I(G)可以以硬接線方式依次插入到基因組，導(dǎo)致A to G的突變。令人驚奇的是，它們中有5個(gè)編輯位點(diǎn)在烏賊（軟體動(dòng)物）中是保守的，而且可能和其他物種中的起源無關(guān)，這表明昆蟲和烏賊（軟體動(dòng)物）之間的RNA編輯在進(jìn)化上是保守的。結(jié)果表明，在野生型病毒BmNPV感染家蠶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Ap2 和AH 這2個(gè)dsRNA能夠有效地抑制病毒DNA的復(fù)制，并且在轉(zhuǎn)染dsRNA后第4天抑制效果最佳，它們使病毒滴度(PFU/mL值)降低了103~104，而另外的dsRNA(Ap1)沒有明顯的抑制效果。目前通過去整合素抑制血管生成已成為治療腫瘤的研究熱點(diǎn)之一。目前為止，還沒有柞蠶桿狀病毒AnpeNPV全基因組序列的報(bào)到。 to 539。相關(guān)研究成果發(fā)表在BMC Genomics上。但是，磷細(xì)胞分化的其他一些元素如ASHl基因仍然能在突變型家蠶中正常表達(dá)。另外，我們推測(cè)，和基于歐幾里得距離的方法相比，基于相關(guān)角的序列相似性分析方法能夠更好地消除DNA序列長度的影響。目前已經(jīng)高效表達(dá)60余種藥用基因蛋白。然而，由于其疏水特性和含量低，膜蛋白的分離純化是一個(gè)眾所周知的難題，也使得膜蛋白的研究陷入困境。（2）首次高效表達(dá)hGMCSF細(xì)胞因子。由此研發(fā)的人用禽流感疫苗已經(jīng)完成臨床前所有研究工作，實(shí)驗(yàn)室效果顯著，可以作為一種高效，廉價(jià)的和安全的人用禽流感疫苗，具備了申報(bào)臨床研究條件。五、對(duì)家蠶蛹的cDNA,microRNA及其特種編輯蛋白的研究首次構(gòu)建家蠶蛹cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)2000多條新的基因，對(duì)其中的100多條基因進(jìn)行了初步的功能研究；建立了一套新的家蠶蛋白組學(xué)研究方法――八孔道加樣和兩步法抽提法，大大提高圖譜蛋白點(diǎn)的檢出率；首次鑒定確認(rèn)46種家蠶蛹的microRNA及其表達(dá)模式，并獲得1000多條可能的microRNA調(diào)控靶基因；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種全新的RNA編輯方式:A to I，揭示RNA編輯可能在進(jìn)化中行使一個(gè)雙重的角色，既產(chǎn)生蛋白表達(dá)的多樣性，又維持蛋白在進(jìn)化上的保守性。獲得國家發(fā)明專利11項(xiàng)，公開國家發(fā)明專利6項(xiàng)，均為第一完成人。1987年獲得南開大學(xué)生物化學(xué)專業(yè)學(xué)士學(xué)位，1994年獲得美國Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)博士學(xué)位。曾獲得過美國Indiana大學(xué)獎(jiǎng)學(xué)金，美國糖尿病學(xué)會(huì)獎(jiǎng)學(xué)金，March of Dime基金會(huì)博士生獎(jiǎng)學(xué)金，Bayer Premier Circle獎(jiǎng)，Bayer質(zhì)量管理優(yōu)秀獎(jiǎng)，AMGEN年度特殊股票獎(jiǎng)以及AMGEN優(yōu)秀成就獎(jiǎng)等獎(jiǎng)勵(lì)。該藥在獲得FDA批準(zhǔn)后的兩季度已創(chuàng)收5千萬美元以上。一種利用囊膜病毒出芽特性高效獲得動(dòng)物膜蛋白的方法完成科研項(xiàng)目21項(xiàng)，在研項(xiàng)目4項(xiàng)，其中國家級(jí)13項(xiàng)，省部級(jí)10項(xiàng)。這種新的表達(dá)系統(tǒng)還可用于表達(dá)一些難表達(dá)難純化的蛋白，如膜蛋白。研究方向和創(chuàng)新點(diǎn)總結(jié)以家蠶作為生物反應(yīng)器，利用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建了系統(tǒng)的家蠶桿狀病毒高效表達(dá)藥用外源蛋白體系，建立了全方位的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)。通過該平臺(tái)，我們已經(jīng)研發(fā)出人用禽流感疫苗并完成臨床前所有研究工作，實(shí)驗(yàn)室效果顯著，可以作為一種高效，廉價(jià)的和安全的人用禽流感疫苗，具備了申報(bào)臨床研究條件。上述研究極大的推動(dòng)了家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用和基因工程生物制藥的發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)基因工程藥物的產(chǎn)業(yè)化提供了新的思路。(5) 基于一種2D圖形表示法的DNA序列的相似性和不相似性分析研究基于一種DNA序列的2D圖形表示法，我們進(jìn)行了敏感性分析，結(jié)果表明該表示法的高性能考慮了DNA序列小的修飾。另外，我們同時(shí)研究磷家蠶ASH1基因，該基因被認(rèn)為在家蠶翅膀發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。總得來說，基于基因內(nèi)容，基因組重排和編碼蛋白的相似性，AnpeNPV屬于Group I NPV，和HycuNPV, EppoNPV, OpMNPV與CfMNPV最相似。經(jīng)分析顯示，僅僅有6個(gè)基因存在于所有的鱗翅目NPV中，12個(gè)基因存在于所有的Group I NPV中。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. Cellular 。去整合素能夠通過其RGD三肽拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，并誘發(fā)其凋亡，從而抑制血管新生血管的生長。相關(guān)研究成果發(fā)表在RNA上。我們分析了不同昆蟲3億多年進(jìn)化過程中Kv2 K+通道蛋白基因的A to I 編輯情況，這些昆蟲包括：Drosophila melanogaster, Culex pipiens (Diptera), Pulex irritans (Siphonaptera), Bombyx mori (Lepidoptera), Tribolium castaneum (Coleoptera), Apis mellifera (Hymenoptera), Pediculus humanus (Phthiraptera)和Myzus persicae (Homoptera)。A to I RNA編輯作為一種遺傳基因重編碼能夠改變蛋白序列高度保守的編碼區(qū)域。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)在Northern blotting中，用來檢測(cè)miRNA的DNA探針甲基化能夠提高探針檢測(cè)的靈敏度。這些研究為家蠶蛋白的表達(dá)和功能分析打下基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果發(fā)表在BMC Genomics上。通過蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)的功能分析，發(fā)現(xiàn)一些重要相關(guān)蛋白質(zhì)，涉及了細(xì)胞骨架蛋白，HSP蛋白家族以及與細(xì)胞周期，凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)蛋白質(zhì)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能通過不同途徑參與了家蠶孤雌生殖的發(fā)育過程并發(fā)揮著不同的功能。采用該制備方法獲得了據(jù)我們所知迄今為止分離蠶卵樣品最多點(diǎn)的蛋白質(zhì)組圖譜，這將有利于更多生物相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)以及鑒定，為構(gòu)建較完善的蠶卵蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。12）；同時(shí)，八孔道加樣器使用簡單和可確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該上樣方式改進(jìn)了傳統(tǒng)的上樣技術(shù)，采用八孔道加樣器和獨(dú)特的上樣程序減小了蛋白樣品的損失。（g）家蠶中一個(gè)新Kazal型蛋白酶抑制劑的表達(dá)、定位及其功能研究Kazal型蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內(nèi)，對(duì)機(jī)體的發(fā)育和免疫應(yīng)答等生理過程發(fā)揮極其重要的作用。RNA中的這些甲基化修飾主要是通過SadenosylLmethionone（AdoMet）依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)來催化的。相關(guān)研究成果發(fā)表在Cell Tissue 。（d）家蠶肌鈣蛋白C基因的研究肌鈣蛋白C（Troponin C, TnC）是一種EF手圖形超家族蛋白，可以結(jié)合Ca2+并發(fā)揮其生物學(xué)功能。這些數(shù)據(jù)表明，在家蠶中維甲酸結(jié)合蛋白的主要功能是影響atRA對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用。維甲酸是一種重要的信號(hào)分子，能通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。這種新的表達(dá)系統(tǒng)可獲得更多的重組目的蛋白，因?yàn)槎嘟求w蛋白基因序列保留越多，則表達(dá)水平越接近天然多角體蛋白的表達(dá)水平（3050%），因而目的蛋白的表達(dá)量可超過5%?；诔鲅坎《静?biāo)記蛋白展示宿主細(xì)胞表面，通過病毒出芽，將宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜剝離于細(xì)胞而獲得純的膜結(jié)構(gòu)達(dá)到分離獲得膜蛋白的目的，特別適合分離低豐度膜蛋白。此重組病毒感染家蠶蛹體72小時(shí)，獲得融合蛋白可展示于囊膜病毒囊膜表面的重組病毒。（f）禽流感疫苗豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)資料健康白色豚鼠分別皮下注射禽流感疫苗 1700μg、340μg/()，牛血清白蛋白生理鹽水溶液60mg（2ml）/（）和溶媒2ml/（）劑量，隔日一次，連續(xù)3次進(jìn)行致敏。次）、%NaCl注射液 1 ml/（kg試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗組的高、中劑量組有抵御病毒攻擊的作用。病毒分離、RTPCR結(jié)果顯示重組疫苗可能有抵御病毒攻擊的作用。同時(shí)，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學(xué)活性。相關(guān)研究成果發(fā)表在African J. 。相關(guān)研究成果發(fā)表在Acta Biochim. . 。對(duì)小鼠每天腹腔注射一次含重組蛋白的蠶血淋巴。（ii）家蠶表達(dá)人乳鐵蛋白生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物研究我們獲得了在蠶體中能高效表達(dá)人乳鐵蛋白（hLf）基因的重組家蠶桿狀病毒，在家蠶中表達(dá)量高達(dá)192 μg/ml蠶血淋巴。非肥胖性糖尿病小鼠經(jīng)口服含微克級(jí)的CTB與胰島素B鏈融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實(shí)驗(yàn)表明小鼠胰島發(fā)炎程度顯著減輕。本研究在融合基因CTBINS的5’端融合了部分來自多角體基因的5’非編碼區(qū)（ATAAAT）和編碼區(qū)（ATGCCGAAT）共15bp的核酸序列，因此與原CTBINS融合蛋白相比，經(jīng)過修飾的融合蛋白（mCTBINS）在其N末端增加了兩個(gè)氨基酸ProAsn。這些都暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，而且還有潛在的治療前景。18例惡性腫瘤患者在化療結(jié)束24小時(shí)后開始口服BmrhGMCSF膠囊相對(duì)安慰劑組能明顯減慢或阻止白細(xì)胞下降。同時(shí)骨髓涂片試驗(yàn)表明，口服BmrhGMCSF動(dòng)物的白細(xì)胞中肌胚細(xì)胞和前顆粒性細(xì)胞所占百分比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照組動(dòng)物。相關(guān)研究成果發(fā)表在Appl. Biochem. 。表達(dá)的重組蛋白rhGMCSF分子量為29kDa，脫糖基化分析表明和大腸桿菌表達(dá)rhGMCSF相比，家蠶蛹表達(dá)rhGMCSF經(jīng)過了糖基化后修飾，同時(shí)還可能經(jīng)過了其他的翻譯后修飾。(1) 家蠶生物反應(yīng)器蛋白高效表達(dá)技術(shù)平臺(tái)的構(gòu)建國際上首次克隆并測(cè)序家蠶桿狀病毒（BmNPV）的P10基因（GenBank 登錄號(hào)為S76783），并證明P10啟動(dòng)子也是強(qiáng)啟動(dòng)子，具備作為表達(dá)載體啟動(dòng)子的功能特征，此后，首次利用P10啟動(dòng)子在家蠶細(xì)胞中表達(dá)了氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶；通過野生型家蠶核多角體病毒中國鎮(zhèn)江株BmNPV ZJ8基因組與修飾型苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcNPV BacPAK6基因組在家蠶細(xì)胞內(nèi)同源重組，構(gòu)建成重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒基因工程載體BmBacPAK6。成功構(gòu)建重組可救活線性化家蠶核多角體病毒基因工程載體，篩選效率提高1000倍，時(shí)間縮短10倍；成功構(gòu)建半胱氨酸蛋白缺失型家蠶核多角體病毒基因工程載體，表達(dá)效率提高40%。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文170余篇，其中被SCI收錄 40余篇，編寫專著6本；完成科研項(xiàng)目26項(xiàng)，其中國家級(jí)13項(xiàng)，省部級(jí)10項(xiàng)，在研項(xiàng)目4項(xiàng)；獲得國家發(fā)明專利14項(xiàng)，公開國家發(fā)明專利5項(xiàng)；在國際學(xué)術(shù)刊物