【正文】 合gp64蛋白信號肽與人禽流感H5N1杭州分離株HA蛋白以及gp64蛋白跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)的重組質(zhì)粒，經(jīng)過胞內(nèi)同源重組獲得能高效表達該融合蛋白的桿狀病毒。 mg/()，無毒（影響）（）。（d）禽流感疫苗猴長期毒性試驗食蟹猴連續(xù)8次（每10天給藥1次）、 mg/（kg14天時肺組織的病毒分離結(jié)果均為陰性。重組疫苗對小鼠具有較好的安全性。我們構(gòu)建融合了家蠶囊膜蛋白gp64蛋白N端信號肽和近C端跨膜結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)移載體，可以方便的將目的基因和gp64信號肽與跨膜域融合，融合基因能夠成功在桿狀病毒中表達并展示在桿狀病毒的囊膜表面，形成一個帶外源病毒抗原的偽病毒，該偽病毒具有外源病毒的抗原性，可以作為基因工程疫苗，安全性高。為什么野生病毒感染的家蠶蛹也能發(fā)揮保護作用？雖然其效果和重組病毒相比較差，其機制還有待于進一步研究。其臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還有待于進一步的研究。將含rhOPG372的家蠶血淋巴注射到小鼠腹腔，結(jié)果表明，家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達出的重組人OPG372蛋白具有良好的降血鈣生物活性，+，并呈劑量依賴關(guān)系，6 mg/kg rhOPG372的降鈣效果幾乎與鮭魚降鈣素（sCT）相當。相關(guān)研究成果發(fā)表在Acta 。經(jīng)檢測，我們構(gòu)建的CTB與人胰島素B鏈融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的受體結(jié)合特性以及CTB的抗原性。為了提高融合基因CTBINS在家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達水平，我們同時開展了部分多角體同源序列對外源基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達的影響分析。在體內(nèi)成功誘導(dǎo)免疫耐受需要長期口服大量的蛋白抗原， CTB可作為誘導(dǎo)口服耐受的強大粘膜運載系統(tǒng)，自身抗原通過與CTB蛋白偶聯(lián)可極大地較少口服自身抗原的劑量。5個劑量組27名受試者單次口服150～900μg的rhGMCSF膠囊的一般檢查、血生化、血液學(xué)、尿液和心電圖檢查結(jié)果用藥前后均無具臨床意義的改變，無藥物不良反應(yīng)發(fā)生。109cells/L，遠遠高于陰性對照組的狗。和其他方法相比，該方法純化蛋白的得率提高了大約40％。我們通過重組家蠶桿狀病毒在家蠶蛹中成功表達了人粒細胞巨細胞激落刺激因子（hGMCSF）。這類藥物既可以免去藥物的分離純化過程，又可解除病人注射的痛苦和被感染的危險。我們在國際上首次克隆家蠶桿狀病毒（BmNPV）的P10基因并證明P10啟動子也是強啟動子，具備作為表達載體啟動子的功能特征，首次利用BmNPV P10啟動子在家蠶細胞中表達了氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶。在家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服藥物和疫苗的研究、家蠶功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及家蠶RNA相關(guān)研究中都取得了新的突破。此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蠶細胞中，外源基因表達量比對照高約40％，宿主存活期及產(chǎn)物高表達期延長，從而提高總表達量。我們通過家蠶蛹生物反應(yīng)器高效表達了rhGMCSF，為了進一步研究家蠶蛹所表達的rhGMCSF藥效功能，從家蠶蛹中大規(guī)模純化重組蛋白成為一個較大的挑戰(zhàn)。免疫組化試驗顯示可以在老鼠腸的組織細胞中檢測到BmrhGMCSF。g的BmrhGMCSF制成膠囊，根據(jù)雙處理、雙周期、兩序列的隨機交叉試驗設(shè)計方法，選擇21例志愿者，口服BmrhGMCSF8181。I型糖尿病由胰島素分泌缺陷產(chǎn)生，它是一種針對胰島β細胞的自身免疫性疫病。適時監(jiān)測血糖的實驗結(jié)果亦表明糖尿病的病理癥狀得到明顯延緩，過繼轉(zhuǎn)移實驗亦表明口服該融合蛋白產(chǎn)生了潛在的調(diào)節(jié)性T細胞從而抑制糖尿病的發(fā)生。相關(guān)研究成果發(fā)表在Biotech. Appl. 。(4) 家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)其他口服藥物和疫苗的研究我們同時還開展了其他許多重要藥用蛋白和疫苗的表達和口服研究工作。結(jié)果表明利用重組hLf治療潰瘍性結(jié)腸炎，反映臨床表現(xiàn)的DAI和組織學(xué)得到改善，髓過氧化物酶（MPO）明顯降低，有效的緩解硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性急性結(jié)腸炎，為進一步進入臨床，生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物打下理論基礎(chǔ)。雖然劑量要求比注射方式要重些，但從時間來看，效果比后者持續(xù)的更久些。ELISA 檢測表明在家蠶幼蟲和蛹中，感染重組病毒后第四天hEGF蛋白表達量達到最大。（vii）蠶表達丙肝抗原制備治療和抗丙型肝炎口服藥物的研究用蠶表達的丙型肝炎（HCV）的C+E1基因產(chǎn)物，可以應(yīng)用HCV抗體的檢測，用蠶表達的HCV的C+E1基因產(chǎn)物，經(jīng)過劑型研制，進行動物口服試驗，通過三百只老鼠的試驗，口服組的HCV抗體陽性率超過到95%以上，為口服疫苗的研制提供依據(jù)。將重組桿狀病毒接種蠶蛹后56天收獲蠶蛹，經(jīng)過多步離心、超速離心、區(qū)帶離心、超濾等方法收獲重組桿狀病毒。攻毒后第2天高、中、低劑量組分別有1只動物中和抗體達到1：4，攻毒后第5天高、低劑量組各有1只動物中和抗體達到1：4，攻毒后第7天高、中、低劑量組分別有1只動物中和抗體達到1：8，攻毒后第14天高、中、低劑量組分別有1只動物中和抗體達到1：16。對猴心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和體溫也無明顯影響。（e）禽流感疫苗大鼠長期毒性試驗SD大鼠連續(xù)八次皮下注射給予批號為200610020061201的禽流感疫苗，對大鼠的主要毒副反應(yīng)為注射部位出現(xiàn)肉芽腫樣結(jié)節(jié)但停藥有逐漸縮小的趨勢，個別血液學(xué)指標（Grn↑，MCV↓）和臟器的重量及系數(shù)（肝臟系數(shù)、脾臟重量及系數(shù)↑）的升降影響。目前疫苗I期臨床試驗正在開展中。在重組病毒感染細胞后期112小時，細胞膜由于病毒大量出芽而破碎，但破碎的膜上仍帶有大量的HA融合蛋白。可以達到同時把細胞的膜蛋白和囊泡等膜蛋白分離的目的，對推動膜蛋白組學(xué)的研究增添了新的手段和技術(shù)。通過cDNA文庫的構(gòu)建，我們發(fā)現(xiàn)大量蛹期表達的功能基因，對其中部分功能基因進行了表達，抗體制備和功能研究，為進一步研究這些功能基因在家蠶生長發(fā)育調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)。我們用不同量的dsRNA轉(zhuǎn)染細胞，atRA處理后用MTT試驗檢測細胞的活力，以此確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。通過Western blotting和免疫熒光法分析了兩種1433蛋白的亞細胞定位，Bm1433ζ蛋白既存在于細胞質(zhì)中也存在細胞核中，而Bm1433ε蛋白主要位于細胞質(zhì)中。通過免疫組織化學(xué)實驗，我們也發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在家蠶五齡幼蟲的表皮、氣門、腸道、馬氏管、頭部等組織中，以及蛹的頭部、腸道、體壁等組織中。熒光定量PCR結(jié)果顯示BmPFN蛋白在各組織中絲腺表達量最高，生殖器表達量次之，脂肪體中的表達量最低；在卵、幼蟲、蛹和蛾四個發(fā)育時期中，幼蟲的表達量最高，蛹次之，蛾中較少，卵中表達量最少；同時Western blotting結(jié)果顯示BmPFN在蛹期表達最高，mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平存在一定的差異，該蛋白可能存在翻譯水平的調(diào)控，如microRNA對蛋白表達調(diào)控，生物信息學(xué)分析也表明該基因mRNA存在9個microRNA結(jié)合位點，正在進行進一步的試驗驗證。我們還合成了BmRNAMTase的dsRNA，并轉(zhuǎn)染了家蠶細胞Bm5，通過MTT法測細胞活性，實驗結(jié)果表明， μg/ml、干擾72h后細胞活性明顯降低。提取五齡蠶的各個組織和各個時期（卵，幼蟲，蛹，蛾）的總RNA，進一步用熒光相對定量PCR檢測表明BmSPI在表皮中表達量最高，脂肪體中表達量最低，在幼蟲期中表達量最高，在卵期表達量最低。我們改進的上樣方式通過采用八孔道加樣器，先將水化液轉(zhuǎn)移到膠條槽內(nèi)，再將樣品以均勻滴加的方式分布在水化液滴上，在重漲膠條過程中施加電壓。樣品的制備無疑是蛋白質(zhì)組學(xué)2DE電泳分離最為重要和關(guān)鍵的一步。實驗結(jié)果表明高溫激變方法可獲取較滿意的無性繁殖發(fā)育卵和孵殖率；并且高溫刺激方法獲得的孵化率在一定時間范圍內(nèi)隨著卵齡的增加孵化率有所提高。我們通過果蠅Yellow基因序列進行blast比對分析獲得家蠶Yellow基因的EST序列，然后通過RACE法得到家蠶Yellow蛋白家族成員全長cDNA序列，該蛋白家族包含存在MRJP域和信號肽的7個成員。家蠶基因組草圖預(yù)測得到的蛋白庫，共14,632 潛在蛋白；第二個蛋白庫為從我們構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫得到的蛋白庫，共4,074個30個aa以上的潛在蛋白；第三個蛋白庫為UniProt蛋白庫中下載的家蠶蛋白，共2111個蛋白。鑒定出的新的小RNA命名為bmomiR100like ，它是以miRNA agamiR100為探針，采用生物芯片和Northern blotting鑒定出，但是其前體序列不能折疊為miRNA前體常見的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在預(yù)測的miRNA靶基因中，有61個基因存在多個靶位點，這61個預(yù)測的靶基因應(yīng)該作為將來功能研究的首選基因。我們不僅闡明了A to I RNA 編輯在進化上可需要性的機制，同時證明怎樣預(yù)測核A to I 編輯位點，在這些編輯位點中，RNA編輯發(fā)生將維持蛋白在相近物種中的保守性。另外，比較分析表明，RNA編輯位點通常出現(xiàn)在蛋白編碼區(qū)高度保守的區(qū)域。此外，用熒光顯微鏡觀察dsRNA在細胞內(nèi)的定位，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染24 h后dsRNA開始在細胞核的周圍呈不連續(xù)的聚集狀態(tài)。Agkistin的DNA序列分析表明，它有一個含有RGD序列的去整合素結(jié)構(gòu)域（12191467aa）。我們對AnpeNPV的全基因組進行了測定，該基因組全長126,629 bp，%，大于大部分的桿狀病毒。另外，AnpeNPV編碼兩個conotoxinlike基因同源物ctl1和ctl2，其僅僅在HycuNPV、OpMNPV和LdMNPV中發(fā)現(xiàn)。在家蠶蛹的早期階段，程序性細胞死亡參與了家蠶娥翅膀磷的發(fā)育，在每一個階段，野生型和突變型家蠶都有很大的不同。(4) 蛋白序列相似性分析研究基于所選氨基酸物理化學(xué)屬性，我們開發(fā)了一種動態(tài)的蛋白序列2D圖形表示法。結(jié)果證實了我們方法的可行性。預(yù)計明年將獲得3＋5新藥證書（I類生物制品）。同時建立的家蠶生物反應(yīng)器多角體結(jié)晶特征表達技術(shù)平臺體系能高效真核表達和有效分離純化得到大量接近天然的重組膜蛋白，也為膜蛋白的研究提供了一個新的技術(shù)平臺。建立首個家蠶生物反應(yīng)器制品生物技術(shù)標準，并實現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)。三、桿狀病毒出芽方式建立一個全新的膜蛋白分離技術(shù)利用桿狀病毒出芽時帶走宿主細胞膜成為病毒囊膜這一特征，發(fā)明了宿主細胞膜的分離技術(shù)，獲得并鑒定了6880種家蠶蛹膜相關(guān)蛋白，確定了1883種為膜蛋白，其中333種為全新的首次報道的膜蛋白。《生物化學(xué)研究與應(yīng)用》主編，中國藥學(xué)會高級會員，國家“百千萬人才工程”第一梯隊成員，國家教育部“跨世紀優(yōu)秀人才”計劃成員，國務(wù)院特殊津貼獲得者，霍英東優(yōu)秀青年教師基金獲得者，浙江省有突出貢獻中青年專家，浙江省中青年學(xué)術(shù)帶頭人，浙江省“151人才”工程第一梯隊成員。五攻關(guān)張耀洲100浙江省重大科技創(chuàng)新基地—生物醫(yī)學(xué)工程，浙江省教技發(fā)［05］1號浙江省人民政府張耀洲2000國家自然科學(xué)基金張耀洲8國家自然科學(xué)基金張耀洲14國家自然科學(xué)基金張耀洲8家蠶桿狀病毒P10基因和多角體基因互作調(diào)控30670095國家自然科學(xué)基金張耀洲8家蠶表達hGMCSF口服吸收協(xié)同蛋白因子的分子生物學(xué)Z204267浙江省基金重點項目張耀洲25用家蠶表達的生白藥物有效分子機制研究 浙江省自然科學(xué)基金張耀洲4浙江省自然科學(xué)基金張耀洲浙江省九具有13年的藥物發(fā)現(xiàn)、發(fā)展、商業(yè)化、全球藥品許可報批，以及大型組織的管理經(jīng)驗。1978年于武漢大學(xué)生物系畢業(yè)，1982年1月獲得中科院遺傳所遺傳學(xué)碩士學(xué)位，1988年在美國俄亥俄大學(xué)獲分子與細胞生物學(xué)博士學(xué)位，19。20022003年負責EPOGEN全面質(zhì)量管理，包括FDA申報、生產(chǎn)、檢測技術(shù)更新，該藥年創(chuàng)收達40億美元；2003年以來，主管并完成了30多個不同形式的產(chǎn)品（包括小分子、重組蛋白、單克隆抗體、融合蛋白等藥物）從臨床前研究到商品化的不同發(fā)展時期的IND申報和發(fā)布。五攻關(guān)張耀洲20浙江省省長基金張耀洲40浙江省科委重大項目張耀洲25省科委重點項目張耀洲15省科委重點項目張耀洲用蠶表達rhGMCSF生白藥物有效分子機制的研究教育部跨世紀人才基金張耀洲30用蠶表達EPO制備口服藥物研究教育部骨干教師基金張耀洲6省部級以上科技獎勵一覽表序號獲獎項目名稱等級完成的名次備注1蛋白質(zhì)雙向電泳中關(guān)鍵技術(shù)的研究浙江省高等學(xué)?？蒲谐晒劦谝幻?0072昆蟲桿狀病毒分子生物學(xué)研究浙江省科學(xué)技術(shù)進步二等獎第一名20063家蠶生物反應(yīng)器制備生物制品的方法國家技術(shù)發(fā)明二等獎第一名20044家蠶生物反應(yīng)器高效表達的條件優(yōu)化和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用研究浙江省政府二等獎第一名20025昆蟲桿狀病毒基因研究國家教育部科技進步二等獎第一名19976用蠶表達hGMCSF生產(chǎn)口服生白藥物研究浙江省政府二等獎第一名19987用蠶表達丙肝抗原制藥口服藥物和檢測試劑研究國家教育部科技進步三等獎第一名19998傳染性法氏囊病毒VP2的克隆及其在蠶體中的表達和疫苗功能研究浙江省政府二等獎第二名2000獲得國家發(fā)明專利一覽表序號專利名稱專利號公開(公告)日專利權(quán)人(排序)發(fā)明人(排序)1用蠶表達丙肝抗原制備口服藥物的方法第一名第一名2用家蠶表達重組人血小板生成素制備藥物方法主要從事家蠶基因組學(xué)和生物反應(yīng)器制藥平臺技術(shù)的研究。是蛋白質(zhì)藥物研究的一大突破。首次構(gòu)建家蠶蛹cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)2000多條新的基因，對其中的100多條基因進行了初步的功能研究，為闡明家蠶蛹期蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)和家蠶生長發(fā)育過程中的基因調(diào)控打下基礎(chǔ)；建立了一套新的家蠶蛋白組學(xué)研究方法，該方法采用八孔道加樣方式，使得樣品蛋白質(zhì)回收率比傳統(tǒng)的水化上樣高出約20%，同時開發(fā)了一種新的家蠶卵蛋白樣品制備方法――兩步法抽提法，該方法與傳統(tǒng)的“一步提取法”相比，大大提高圖譜蛋白點的檢出率， 采用該方