【正文】 法我們獲得了迄今為止分離蠶卵樣品最多點(diǎn)的蛋白質(zhì)組圖譜，這將有利于更多生物相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)以及鑒定；首次鑒定確認(rèn)46種家蠶蛹的microRNA及其表達(dá)模式，并獲得1000多條可能的microRNA調(diào)控靶基因，為研究microRNA對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育中的基因調(diào)控打下基礎(chǔ)，相關(guān)論文發(fā)表1個(gè)月被下載次數(shù)高達(dá)1000多次，被評(píng)為高訪問(wèn)率論文。一旦大規(guī)模爆發(fā)這類傳染性疾病，采用傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)體系根本不可能及時(shí)生產(chǎn)出充足的疫苗來(lái)應(yīng)對(duì)突然出現(xiàn)的緊急疫情。科學(xué)意義我們構(gòu)建的可救活家蠶桿狀病毒線性化重組病毒，使重組病毒篩選率幾乎為100％，同時(shí)表達(dá)效率提高40％，表達(dá)量極高，每kg蛹可以獲得外源蛋白或重組病毒量達(dá)到100mg，成本低，且表達(dá)產(chǎn)物和天然蛋白接近，生物活性高。該方法簡(jiǎn)單，方便快速。在突變體中，Caspase3/7 蛋白的活性在化蛹后第1天達(dá)到最大，其活性是野生型的10倍多。這些dr區(qū)AT含量高，存在于基因組的基因間區(qū)，推測(cè)可能是非hr的復(fù)制起始區(qū)，非hr的復(fù)制起始區(qū)在GrleGV, CpGV和AdorGV等GV中存在。因此，仍然有29個(gè)保守基因存在與所有桿狀病毒中，仍然有33個(gè)保守基因存在于所有鱗翅目桿狀病毒中。 μM濃度下，agkistins能夠以劑量效應(yīng)有效的抑制BAECs的遷移、擴(kuò)增和生長(zhǎng)。六、其他研究(1) 蛇毒去整合素agkistins的表達(dá)及功能研究我們開(kāi)展了蛇毒去整合素結(jié)構(gòu)域agkistins的表達(dá)及功能研究。我們同時(shí)闡述了一個(gè)非保守編輯位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換模式。相關(guān)研究成果發(fā)表在RNA上。相關(guān)研究成果發(fā)表在BMC Genomics上。Northern blotting顯示某些家蠶miRNA只在家蠶某些特定的發(fā)育階段表達(dá)，揭示這些miRNA可能呈發(fā)育時(shí)序特異性表達(dá)（如bmomiR277）。通過(guò)比對(duì)分析，上述構(gòu)建的三個(gè)蛋白庫(kù)中分別有6649, 250和868個(gè)蛋白能夠和質(zhì)譜序列進(jìn)行匹配，%, %, 和43%。通過(guò)RTPCR，我們研究了家蠶Yellow蛋白家族基因的組織表達(dá)譜。我們采取上述開(kāi)發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段分析了家蠶有性和孤雌生殖蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化。本研究工作成功建立的一種蠶卵蛋白質(zhì)制備的新方法，通過(guò)采取獨(dú)特的預(yù)分離策略有效減少了蠶卵樣品中高豐度蛋白質(zhì)含量，從而提高了低豐度蛋白質(zhì)的上樣量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法電泳結(jié)果較常規(guī)的水化上樣有明顯的改善（952177。相關(guān)研究成果發(fā)表在Comp. Biochem. 。DNA Ladder實(shí)驗(yàn)表明，干擾后死細(xì)胞數(shù)量增加，但細(xì)胞并未發(fā)生正常的凋亡現(xiàn)象，推測(cè)是干擾后一些非正常因素導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。相關(guān)研究成果發(fā)表在Appl. Biochem. 。我們還利用熒光定量PCR的方法，對(duì)家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾等發(fā)育時(shí)期，以及五齡幼蟲各組織中的靶mRNA的量進(jìn)行比較。我們同時(shí)研究了Bm1433ζ在蛹、絲腺、頭部、脂肪體以及腸中的結(jié)合蛋白，電泳分析發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)組織中可與Bm1433ζ蛋白結(jié)合的蛋白至少有4個(gè)組分，這些組分的大小主要位于28~54 kDa之間，Bm1433ζ在各組織的結(jié)合蛋白大小非常相似，這說(shuō)明Bm1433ζ在細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。隨后用pEGFPC1CRABP和dsRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，MTT試驗(yàn)表明，當(dāng)Bm5細(xì)胞過(guò)量表達(dá)CRABP時(shí)，用atRA處理后，細(xì)胞對(duì)atRA誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制產(chǎn)生耐受性；當(dāng)CRABP的表達(dá)被干擾而降低時(shí)，細(xì)胞對(duì)atRA引起的生長(zhǎng)抑制作用更加敏感。相關(guān)研究成果發(fā)表在Appl. Biochem. 。四、家蠶生物反應(yīng)器多角體結(jié)晶特征表達(dá)技術(shù)平臺(tái)體系構(gòu)建將多角體基因與目的基因融合，克隆到轉(zhuǎn)移載體中，再通過(guò)在家蠶細(xì)胞BmN中與線性化BmBacPAK6病毒發(fā)生同源重組得到多角體融合表達(dá)載體，其不僅恢復(fù)了必需基因ORF1629，救活了病毒，而且恢復(fù)了多角體基因。掃描電鏡證實(shí)破裂的帶有HA活性的膜成分以囊球狀存在。三、基于桿狀病毒出芽方式的全新膜蛋白分離技術(shù)平臺(tái)體系的構(gòu)建桿狀病毒在細(xì)胞的感染初期以出芽病毒的方式穿過(guò)細(xì)胞膜并帶走細(xì)胞膜以囊膜病毒的形式存在。中毒劑量未明顯顯示。對(duì)大鼠、小鼠皮下注射的最大耐受劑量分別為：大鼠 94mg/kg（相當(dāng)于人臨床擬用劑量的18800倍、大鼠有效劑量的250倍）；小鼠 141mg/kg（相當(dāng)于人臨床擬用劑量的28200倍、小鼠等效劑量的263倍）。病毒接種后第7天，低劑量組和模型對(duì)照組各有1只動(dòng)物的肺組織中分離出病毒。(3) 重組人用禽流感疫苗臨床前的有效性評(píng)價(jià)每組14只的BALB/C小鼠按高中低劑量組分別以150μg/kg體重，30μg/kg體重，6μg/kg體重免疫總體積1ml的禽流感疫苗，免疫3次，每次間隔2周，抗體效價(jià)達(dá)到最高峰時(shí)攻毒，觀察疫苗的免疫保護(hù)效果。二、家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)平臺(tái)體系的構(gòu)建與安全有效的人用禽流感疫苗的快速制備(1) 家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)平臺(tái)體系的建立家蠶桿狀病毒gp64蛋白N端為信號(hào)肽序列，近C端為跨膜結(jié)構(gòu)域，外源蛋白在信號(hào)肽的C 端與跨膜結(jié)構(gòu)域N 端之間發(fā)生融合，融合蛋白經(jīng)過(guò)真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工后，信號(hào)肽被切除，形成的N端融合蛋白可穩(wěn)定地展示于桿狀病毒的表面，形成刺猬狀“偽病毒”。動(dòng)物試驗(yàn)表明，感染重組病毒和野生病毒的家蠶蛹都能保護(hù)小鼠胃粘膜防止酒精誘導(dǎo)的胃損害。以上結(jié)果表明，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的OPG具有潛在預(yù)防和治療高血鈣、骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的功能。（iii）家蠶表達(dá)人破骨細(xì)胞形成抑制因子生產(chǎn)口服治療高血鈣、骨質(zhì)疏松癥藥物的研究我們獲得了在家蠶中能高效表達(dá)破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG及變體OPG372的重組桿狀病毒病毒，并發(fā)現(xiàn)rhOPG在家蠶幼蟲的表達(dá)產(chǎn)物還有二聚體的形式。在將表達(dá)的幾種SARS基因疫苗注入實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)后，成功地在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)檢測(cè)到了非典（抗SARS病毒）抗體，而非接種組均無(wú)抗體反應(yīng)。胰島素B鏈包含了胰島素的主要抗原決定族，僅僅口服胰島素B鏈在動(dòng)物模型中同樣能抑制糖尿病的發(fā)生，其效果與口服胰島素完整蛋白相近。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. . . ?？诜膊√禺愋宰陨砜乖苷T導(dǎo)口服免疫耐受，并能有效延緩或抑制自身免疫性疾病癥狀的發(fā)生。受試者的血漿經(jīng)質(zhì)譜分析找到了來(lái)自hGMCSF的相關(guān)片段的序列，序列最大分子量達(dá)到7336Da，最小達(dá)到2039 Da，說(shuō)明BmrhGMCSF經(jīng)過(guò)口服能被人體吸收。動(dòng)物藥理學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：（1）BmrhGMCSF能提高白細(xì)胞減少癥小鼠脾臟的CFUS形成能力和骨髓細(xì)胞中DNA合成能力；（2）BmrhGMCSF能顯著誘導(dǎo)恒河猴和狗骨髓粒細(xì)胞和核細(xì)胞的生長(zhǎng)，口服BmrhGMCSF9天后，動(dòng)物的白細(xì)胞水平顯著提高，且呈劑量依賴關(guān)系。研究表明，采用等電點(diǎn)沉淀法可能更加有效，通過(guò)這種方法，我們從1000g接種感染的蠶蛹中純化得到95％，106 cfu mg1。(2) 口服有效的rhGMCSF蛋白藥物的制備及其生白效果至今，有很多的外源蛋白在家蠶細(xì)胞和幼蟲中得到表達(dá)，但作為生物反應(yīng)器，家蠶蛹可能更加適合表達(dá)外源目的基因。家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)證實(shí)可以直接用于口服藥物的開(kāi)發(fā)，目前已經(jīng)證明家蠶表達(dá)生產(chǎn)的藥物由于有蠶血淋巴本身的大量蛋白的保護(hù)作用和一些未知的機(jī)理，直接經(jīng)口服給藥而進(jìn)入血液循環(huán)。平臺(tái)簡(jiǎn)介：以家蠶作為生物反應(yīng)器，利用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建了系統(tǒng)的家蠶桿狀病毒高效表達(dá)藥用外源蛋白體系，建立了全方位的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)。平臺(tái)具體內(nèi)容、研究成果：一、家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服蛋白質(zhì)藥物技術(shù)平臺(tái)體系的構(gòu)建通過(guò)一系列的新型基因工程載體的構(gòu)建，成功建立家蠶生物反應(yīng)器蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)構(gòu)建一系列的新型重組病毒和新型表達(dá)載體，形成全新的家蠶生物反應(yīng)器蛋白高效表達(dá)技術(shù)平臺(tái)。我們建立了兩個(gè)大量純化重組蛋白的方法：分別采用硫酸銨分級(jí)沉淀和等電點(diǎn)沉淀法得到重組蛋白的初步純化產(chǎn)物，然后再結(jié)合凝膠過(guò)濾和離子交換色譜法得到純化的蛋白。這些結(jié)果表明BmrhGMCSF可能通過(guò)動(dòng)物腸微絨毛被吸收到動(dòng)物血液中。g/ /kg，給藥后按0、ELISA法測(cè)定血液中hGMCSF濃度，結(jié)果表明19人口服BmrhGMCSF后，有15人血液中檢測(cè)到與正常血漿有顯著差異的血藥濃度，用梯形面積法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積AUC，根據(jù)試驗(yàn)品的AUC與參比品的AUC比值計(jì)算相對(duì)生物利用度F值，%，%，％。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)口服一種自身抗原，如胰島素或GAD，即誘導(dǎo)了免疫耐受，產(chǎn)生了保護(hù)作用，進(jìn)而抑制糖尿病的發(fā)生。這些結(jié)果表明家蠶生物反應(yīng)器是一個(gè)合適的生產(chǎn)口服疫苗系統(tǒng)，并通過(guò)該系統(tǒng)誘導(dǎo)針對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的免疫耐受，該研究是利用我國(guó)自身蠶業(yè)資源優(yōu)勢(shì)研制抗I型糖尿病口服疫苗，為I型糖尿病的治療開(kāi)辟了新的途徑。我們同時(shí)關(guān)注口服家蠶表達(dá)CTB與胰島素B鏈融合蛋白對(duì)治療糖尿病的效果。（i）家蠶表達(dá)SARS基因制備抗SARS病毒口服疫苗的研究我們獲得了SARS病毒基因組中與致病性相關(guān)的若干個(gè)基因，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后克隆至重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8中，與線性化的桿狀病毒共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)重組病毒篩，獲得高效表達(dá)重組桿狀病毒。 Biochim. Biophys. 。我們將雌性小鼠的卵巢切割，模擬婦女絕經(jīng)后雌激素分泌下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，將含重組蛋白OPG的蠶血淋巴對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白能有效的阻止因雌激素缺失導(dǎo)致的骨流失。表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞粗提物和感染重組病毒的家蠶幼蟲血淋巴都能有效地促進(jìn)Balb/c 3T3細(xì)胞的分化?！坝眯Q表達(dá)丙肝抗原制備口服藥物的方法”已獲得國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：）。每100g蠶蛹生產(chǎn)重組桿狀病毒816mg。病毒接種后第2天，中劑量組各有1只動(dòng)物的咽拭子為陽(yáng)性，高、低劑量組未分離出病毒，模型對(duì)照組均為陽(yáng)性，第14天的咽拭子均未分離出病毒。（c）禽流感疫苗大鼠、小鼠急性毒性試驗(yàn)健康清潔級(jí)SD大鼠和ICR小鼠分別單次皮下注射（sc）給予禽流感疫苗94mg/kg和141mg/kg劑量，～。毒性靶器官為脾臟，但呈可逆性影響。上述研究成果發(fā)表在PLoS ONE上。通過(guò)離心純化獲得的上清經(jīng)過(guò)750kD超濾后活性部分仍能夠被膜截獲，被膜截獲的部分再經(jīng)過(guò)密度梯度離心，收集帶HA活性的部分，從而獲得了剩余的膜成分。相關(guān)研究成果發(fā)表在proteomics上。（a）家蠶蛹cDNA文庫(kù)的構(gòu)建我們構(gòu)建了家蠶蛹cDNA文庫(kù)并測(cè)定了2233個(gè)新的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：DN236876DN23789DN591076DN59708DN985172DN98531DN985369DN98537DY230449DY231514），以浙江理工大學(xué)名義獨(dú)立列入國(guó)際上具有重要影響的家蠶KAIKO數(shù)據(jù)庫(kù)中（），成為世界共享資源。這個(gè)試驗(yàn)不僅證明干擾BmCRABP的表達(dá)使細(xì)胞對(duì)RA引起的生長(zhǎng)抑制更加敏感，同時(shí)也證明了轉(zhuǎn)染的有效性。這些說(shuō)明Bm1433ζ可能是組成性表達(dá)，而Bm1433ε的表達(dá)具有時(shí)期和組織特異性，且兩種1433蛋白可能對(duì)絲腺的基因表調(diào)控以及絲蛋白的形成具有重要作用。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該蛋白主要存在細(xì)胞質(zhì)中。RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示BmPFN在家蠶細(xì)胞正常的增殖中起重要作用。同時(shí)，在干擾72 h后，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明，RNAi后細(xì)胞中的蛋白量明顯減少。將制備的雙鏈RNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶Bm5細(xì)胞，干擾后進(jìn)行PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)干擾組與對(duì)照組的細(xì)胞沒(méi)有顯著差異，沒(méi)有引起細(xì)胞凋亡。改進(jìn)的上樣方式減小了水化上樣2DE過(guò)程中蛋白質(zhì)的丟失，有利于膠條對(duì)蛋白質(zhì)的吸收。在對(duì)家蠶卵進(jìn)行2DE分離時(shí)，我們注意到由于卵的一些高豐度蛋白質(zhì)如卵黃磷蛋白質(zhì)(Vtn )、卵特異蛋白(ESP)和30 KP 家族蛋白質(zhì)在樣品中占據(jù)了相當(dāng)?shù)谋壤?，?dǎo)致了許多低豐度蛋白質(zhì)很難被檢測(cè)。本研究因此獲得了足量樣品量以用于蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)研究目的。遺傳進(jìn)化分析表明，家蠶Yellow蛋白家族成員組成一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化群，與果蠅和蜜蜂Yellow蛋白家族不在一個(gè)進(jìn)化區(qū)。.通過(guò)質(zhì)譜分析，我們共得到threshold分大于60%的肽序列共81,000 個(gè)，其中55,400個(gè)有效序列進(jìn)行了蛋白庫(kù)比對(duì)分析。在這些鑒定出的miRNA中，有12對(duì)miRNAs和miRNA*s。預(yù)測(cè)miRNA靶基因的生物學(xué)分類（GO分類）表明，binding, catalytic activity 和 physiological process為預(yù)測(cè)靶基因的主要功能關(guān)鍵詞。通過(guò)試驗(yàn)我們鑒定出一個(gè)新的RNA編輯位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)位于calcium channel a1基因第四個(gè)外顯子中。但在其他物種中的蛋白同源物有一半多還是通過(guò)基因組序列編碼的。相關(guān)研究成果發(fā)表在Chinese Science Bulletin上。為了研究agkistin去整合素結(jié)構(gòu)域，agkisgins的功能，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了agkistins，并進(jìn)一步研究其功能。經(jīng)分析AnpeNPV含有147個(gè)編碼氨基酸大于50的ORF框，在這147個(gè)ORF中，有143個(gè)ORF編碼的蛋白能在其他桿狀病毒中找到同源蛋白，4個(gè)基因?yàn)樾禄?，在其他已測(cè)序桿狀病毒找不到同源基因。和其他桿狀病毒不同的是，AnpeNPV僅僅包含3個(gè)典型的hr區(qū)，然而卻含有24個(gè)完美或非完美的dr區(qū)。在突變型家蠶中，良好分化的磷前體細(xì)胞不會(huì)形成。然后，我們介紹和比較了兩個(gè)蛋白圖形的數(shù)字特征，其作為分析9個(gè)ND5蛋白的描述器。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. Comput. 。近幾年來(lái)，世界各地相繼爆發(fā)各種病毒性傳染性疾病，如SARS、禽流感等，極大地威脅著人們的健康和生命。該平臺(tái)還能夠生產(chǎn)制備注射水平的蛋白藥物，為家蠶生物反應(yīng)器高效表達(dá)大量的純的可達(dá)到注射藥物水平的重組蛋白提供了全新的技術(shù)平臺(tái)體系。建設(shè)家蠶生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)藥物，并可以通過(guò)口服途徑給藥。利用病毒出芽獲得純的宿主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，為研究膜蛋白提供了一個(gè)有效的膜蛋白分離技術(shù)，解決了膜蛋白分離難的問(wèn)題。浙江省重中之重科技創(chuàng)新基地、浙江省家蠶生物反應(yīng)器及生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生物醫(yī)藥工程學(xué)科帶頭人。五重點(diǎn)課題張耀洲30浙江省九在2000年曾帶領(lǐng)30多人的團(tuán)隊(duì)僅用一年的時(shí)間完成了4個(gè)生產(chǎn)地質(zhì)量系統(tǒng)的統(tǒng)一設(shè)計(jì)和重建項(xiàng)