【正文】 上發(fā)表研究論文37篇；申請國家發(fā)明專利17項，獲得國家發(fā)明專利7項。BmBacPAK6用作載體表達人EPO基因，感染家蠶蟲體和家蠶蛹時，104U/ml血淋巴；在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程載體，通過一種半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蠶核多角體病毒BmZJCP基因組DNA和構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pCPGFP與上述BmBacPAK6共轉(zhuǎn)染家蠶細胞，經(jīng)細胞內(nèi)同源重組獲得。相關(guān)研究成果發(fā)表在J. 。動物試驗表明，口服BmrhGMCSF15分鐘后，可以在老鼠的血液中檢測到20kDa125I標記的BmrhGMCSF蛋白片段。為了研究家蠶生物反應(yīng)器表達的BmrhGMCSF在人體內(nèi)的口服吸收利用度，我們以每100mg蠶蛹粉中含12181。(3) 糖尿病基因工程口服疫苗的制備及其對I型糖尿病的治療研究由于家蠶生物反應(yīng)器表達蛋白進行翻譯后修飾，其表達產(chǎn)物生物活性可以和天然蛋白相媲美，我們開展了口服家蠶表達霍亂毒素B亞基（CTB）與胰島素融合蛋白對治療自身免疫性糖尿病的研究。非肥胖性糖尿?。∟OD）小鼠經(jīng)口服含微克級的CTB與胰島素融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實驗表明胰島發(fā)炎程度顯著減輕。因此，本實驗中所使用的15bp多角體同源序列可被用作為一個結(jié)構(gòu)元件，在多角體啟動子下游促進外源基因的高效表達。相關(guān)研究成果發(fā)表在Vaccine上?？瞻讓φ战M每日灌喂等量蒸餾水。結(jié)果表明，通過口服方式，一定劑量的重組蛋白也能有效的降低小鼠的血清鈣離子濃度。（v）人EGF基因的表達與治療胃潰瘍的研究我們通過家蠶生物反應(yīng)器大量表達人表皮生長因子hEGF蛋白，通過和多角體蛋白融合，在多角體啟動子的啟動下在家蠶細胞BmN，幼蟲和蛹中被高效表達。“用家蠶表達重組人促紅細胞生成素制備藥物的方法”已獲得國家發(fā)明專利（專利號：）。重組桿狀病毒接種家蠶蛹，建立以家蠶蛹為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組疫苗的生產(chǎn)工藝。免疫后動物未出現(xiàn)異常的臨床表現(xiàn)，提示疫苗具有較好的安全性。在本試驗劑量條件下，批號為20061207的禽流感疫苗對小鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響。禽流感疫苗在高達人臨床擬用劑量640倍的劑量下對猴的主要毒性反應(yīng)僅表現(xiàn)為注射部位結(jié)痂、紅斑等損傷。上述結(jié)果表明家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的禽流感疫苗可以作為一種高效，廉價的和安全的人用禽流感疫苗。由此表明，通過重組病毒的純化可以有效地分離細胞膜成分，并因此有效獲得了膜蛋白質(zhì)。綜上所述，基于桿狀病毒出芽病毒的特殊性，結(jié)合病毒表達標記蛋白于宿主細胞表面對分離細胞內(nèi)其他帶膜結(jié)構(gòu)囊泡的膜蛋白組研究也是一個很好的方法和技術(shù)。150100755037圖1. 融合蛋白的表達五、家蠶的分子生物學(xué)研究(1) 家蠶功能基因?qū)W研究為了探索與家蠶經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因的功能及其表達調(diào)控的機理和家蠶發(fā)育過程中蛋白質(zhì)相互作用，我們構(gòu)建了家蠶蛹cDNA文庫，這對于了解蠶蛹變態(tài)期間所發(fā)生的生理生化反應(yīng)具有重要的意義。首先，我們重組了真核表達質(zhì)粒pEGFPC1CRABP，并用BmCRABP的ORF制備了RNAi用的dsRNA，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細胞Bm5后，細胞會過量表達CRABP或抑制CRABP的表達。相似EST搜索、熒光定量PCR和Western blotting分析表明Bm1433ζ存在于家蠶各個組織及各個時期，Bm1433ε除了在卵以及頭部中沒有發(fā)現(xiàn)外，在其他組織及時期都有表達；Bm1433ζ的表達量在各個組織及時期均比Bm1433ε高；兩種1433蛋白在絲腺中都有大量表達。Western blotting表明，BmTnC蛋白在家蠶的表皮、腸道、頭、馬氏管、睪丸等組織中都有表達，且表達量依次降低，而在絲腺和脂肪體中我們并沒有檢測到該蛋白的存在。亞細胞定位研究表明BmPFN主要分布于細胞質(zhì)中。免疫熒光細胞定位實驗結(jié)果表明，RNA MTase大量存在于細胞質(zhì)中，同時細胞核中也有RNA MTase存在，但量相對較少。取五齡家蠶做橫切冷凍切片，用Cy3標記的羊抗兔二抗做免疫組織定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白幾乎遍及各組織中，特別是表皮中含量最高。水化上樣方式極大的受到了上樣過程中蛋白質(zhì)吸附現(xiàn)象的影響，導(dǎo)致樣品蛋白質(zhì)損失達2555%；杯上樣的2DE圖譜結(jié)果通常優(yōu)于水化上樣，但耗時較長；而且水化后需人工將膠條轉(zhuǎn)移至等電聚焦裝置，容易帶進人為的誤差。新的樣品制備方法采用兩步法抽提易溶性和難溶性樣品后，再將易溶性樣品以優(yōu)化比例加入到難溶性樣品，從而大大降低了易溶性高豐度蛋白的干擾。為獲得家蠶有性生殖與孤雌生殖卵及蟻蠶樣品，我們采用浸酸處理獲得有性生殖樣品及Astaurov的溫湯處理作為孤雌誘導(dǎo)條件，并在前人研究基礎(chǔ)和本實驗室現(xiàn)有條件下對家蠶孤雌生殖孵化的一些處理條件做了實驗條件摸索。目前為止，在鱗翅目昆蟲中還沒有該蛋白家族的報到。為了研究家蠶蛋白表達，我們首先構(gòu)建了三個推測蛋白庫：第一個蛋白庫為從9180。我們通過基于序列的同源性搜索，結(jié)合基于生物芯片和Northern blotting試驗驗證方法在家蠶中首次鑒定 了46個miRNA，21個可能的miRNA和1個新的小RNA。在這些靶位點中，338個能夠和43個miRNA種子區(qū)很好地配對。我們開發(fā)了一種模型，在這個模型中，核A to I RNA編輯能夠充當一種進化中基因變異的中介?；谶@個結(jié)果，我們在烏賊synaptotagmin I蛋白轉(zhuǎn)錄物中預(yù)測并通過試驗驗證了2個新的A to I編輯位點。RTPCR和DNA斑點雜交也證實了2種目的基因的表達水平和病毒DNA的量發(fā)生了明顯的下調(diào)。我們試驗室利用RTPCR從江浙蝮蛇的毒腺中克隆出一PII型蛇毒金屬蛋白酶Agkistin。AnpeNPV是柞蠶膿病的病原體，其全基因組序列的測定為柞蠶膿病的防治提供理論依據(jù)。 repair exonuclease)，其僅僅在Group I NPV中的CfMNPV和CfDEFNPV中發(fā)現(xiàn)，該基因可能通過基因的橫向轉(zhuǎn)移來源于病毒的某個宿主。(3) 家蠶無磷翅膀突變的研究家蠶無磷翅膀的突變在形態(tài)學(xué)上報到過，我們在發(fā)育水平上闡明了這種突變的機制。相關(guān)研究成果發(fā)表在Dev. Genes 。應(yīng)用這種的方法，我們考察了不同物種betaglobin基因第一個外顯子編碼序列的相似性和非相似性。其中hGMCSF口服膠囊已經(jīng)進入II、III期臨床研究。我們通過桿狀病毒出芽方式建立了一個全新的膜蛋白分離技術(shù)平臺體系，解決了膜蛋白分離純化的難題，為研究膜蛋白提供了一個有效的膜蛋白分離技術(shù)，能極大促進膜蛋白的研究。開拓了蛋白質(zhì)細胞因子通過口服直接給藥途徑并在國際上第一個獲得臨床研究批文。建立了一整套全新的“偽病毒”疫苗生產(chǎn)技術(shù)體系和標準，為基因工程疫苗生產(chǎn)體系增加了一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的技術(shù)平臺。團隊研究人員介紹張耀洲，男，1964年2月5日出生，教授, 博士生導(dǎo)師, 現(xiàn)任天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院副院長，浙江理工大學(xué)生物化學(xué)研究所所長，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會常務(wù)理事兼分子生物技術(shù)專業(yè)委員會（籌）主任委員，浙江省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會理事長。承擔國家攻關(guān)、“973”、“863”和浙江省重中之重等課題科研總經(jīng)費達到4300萬元承擔的科研項目項目、課題名稱（下達編號）項目來源項目起訖時間負責(zé)人科研經(jīng)費（萬元）家蠶小分子mRNA、小肽工能以及病原體與宿主相互作用機理研究2005CB121006973子項目張耀洲240家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)新型人用禽流感疫苗的試制2006BA101B04國家科技支撐計劃項目陳建國張耀洲700家蠶功能基因篩查及鑒定關(guān)鍵技術(shù)， 國家“863” 重大項目張耀洲300國家“863” 重大項目張耀洲300國家“863”滾動項目張耀洲200國家“863”計劃張耀洲100蠶表達重組人粒細胞巨噬細胞集落因子（rhGMCSF）國家九歷任美國Centeon（現(xiàn)在為Aventis）制藥公司臨床前研發(fā)部高級研究員，美國Bayer制藥公司生產(chǎn)流程開發(fā)部高級研究員、分析開發(fā)部部門主管，美國AMGEN公司質(zhì)量部高級經(jīng)理、副部長、部長、執(zhí)行部長。周澤奇，男，56歲，天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院專職副院長。20032006年，推進12個新藥進入臨床I期、2個進入臨床Ⅱ期，并獲得在美國和歐洲進行臨床Ⅲ期的許可；2006年提交抗腫瘤藥物（Vectibix）全球性的生物許可申請，并在同年9月獲得FDA批準，正在申請歐盟、加拿大、日本和澳大利亞的正式批準。第一名第一名3用家蠶表達重組人促紅細胞生成素制備藥物的方法第一名第一名4用蠶生產(chǎn)基因工程生白細胞藥物的方法第一名第一名5一種用蠶制備抗腫瘤治療藥物的方法第一名第一名6霍亂毒素B亞基的制法第二名第一名7用蠶表達人表皮生長因子生產(chǎn)藥物的方法，第一名第一名8用蠶表達人α2b干擾素制備藥物的方法第一名第一名9用蠶表達人β干擾素制備藥物的方法第一名第一名10一種用蠶表達人白細胞介素11生產(chǎn)藥物的方法ZL 第一名第一名11一種用蠶生產(chǎn)抗血栓藥物的方法ZL 第一名第一名12一種制備動物細胞膜及細胞器的膜蛋白的方法第一名第一名13在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文200余篇，其中被SCI、EI收錄 50余篇。四、家蠶生物反應(yīng)器多角體結(jié)晶特征表達蛋白在桿狀病毒線性化缺失多角體基因的基礎(chǔ)上，重新引進家蠶桿狀病毒多角體基因，與外源基因融合表達，表達水平大大提高，幾乎接近野生病毒多角體表達水平，表達量達到14mg/蛹（2g）。這一技術(shù)平臺具有廣泛性，已經(jīng)被國際同行所認可。同時發(fā)現(xiàn)了一種全新的RNA編輯方式:A to I，揭示RNA編輯的雙重角色，既產(chǎn)生蛋白表達的多樣性，又維持蛋白在進化上的保守性，為RNA所行使的功能提供了新的注解。我們構(gòu)建的家蠶生物反應(yīng)器桿狀病毒表面展示技術(shù)平臺體系建立了一整套全新的“偽病毒”疫苗生產(chǎn)技術(shù)體系和標準，應(yīng)用該技術(shù)平臺可以生產(chǎn)各種通用性疫苗，并且能在10天左右規(guī)?；a(chǎn)充足的病毒疫苗，可以用來快速應(yīng)對各類爆發(fā)性傳染性疾病疫情，減少疫情的擴散和威脅。同時研究表明，家蠶生物反應(yīng)器所表達的重組藥用蛋白可以通過口服被人體吸收，解決了蛋白藥物不能口服給藥的國際難題。相關(guān)研究成果發(fā)表在Proteins上。細胞調(diào)亡和DNA ladder研究也表明，在突變型中，早期蛹翅膀中存在過多的調(diào)亡。另外，我們在病毒基因組的基因內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了9個dr。另外，存在于所有鱗翅目桿狀病毒中的保守基因仍然是74個，但這74個基因和前面文獻報到的74個基因不同，這是因為一些新的桿狀病毒被測定。通過雞胚尿馕膜試驗研究發(fā)現(xiàn)，agkistins能夠有效的抑制雞胚自發(fā)性血管生長，通過caspase途徑誘導(dǎo)BAECs細胞的調(diào)亡。去整合素（disintegrin）是從蛇毒中分離出含有ArgGlyAsp(RGD)或LysGlyAsp(KGD)結(jié)構(gòu)域的富含半胱氨酸的一群低分子量多肽。這些數(shù)據(jù)暗示RNA編輯可能在進化中行使一個雙重的角色，既產(chǎn)生蛋白表達的多樣性，又維持蛋白在進化上的保守性。 A to I RNA編輯產(chǎn)生基因重編碼的分子機制和生理機能已經(jīng)比較清楚，但是人們對其進化意義還不是很了解。（b） 家蠶RNA編輯研究RNA編輯能夠通過改變某個特定的密碼子使得mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達呈現(xiàn)多樣性。我們在家蠶基因組中鑒定了2個miRNA基因族，其中，bmomiR2b屬于基因族bmomiR2a1/bmomiR2a1*/bmomiR2a2/bmomiR2b/bmomiR13a*/bmomiR13b, 其為mir2 基因家族的新成員。通過生物信息學(xué)進行功能分析表明，匹配的蛋白中有1517個蛋白存在預(yù)測的跨膜區(qū)；1165個蛋白存在信號肽。家蠶Yellow蛋白家族至少包含7個成員，每個成員較低的同源性和獨特的表達模式預(yù)示家蠶Yellow蛋白家族可能在家蠶發(fā)育過程中發(fā)揮重要的生理功能。通過2DE分離和電泳圖像分析、對差異點進行膠內(nèi)酶解以及MALDI MS和MS/MS的鑒定，共有46個差異蛋白質(zhì)得到了可信的確認。與傳統(tǒng)的“一步提取法”的比較顯示出，該方法大大提高圖譜蛋白點的檢出率；選取了部分獨有的蛋白質(zhì)點進行了成功的基質(zhì)輔助的激光解吸飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFTOF MS）鑒定和功能分類及分析，證實了該方法應(yīng)用于研究對象的有效性和適用性。15 vs 586177。(2) 家蠶蛋白質(zhì)組學(xué)研究（a）家蠶蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺的優(yōu)化及有性與孤雌生殖的比較蛋白質(zhì)組研究為了提高家蠶卵蛋白二維電泳分析效率，我們開發(fā)了一種新型的2DE樣品上樣方式。相關(guān)研究成果發(fā)表在Comp. Funct. 。（f）家蠶AdoMet依賴的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的RNAi及亞細胞定位研究RNA甲基化是細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后加工過程的一種形式，存在于各種生物體內(nèi)，與生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白修復(fù)、染色體調(diào)控及基因沉默等均有較大關(guān)系。用Protein A凝膠柱純化多克隆抗體，并將純化所得的抗體用于制作免疫親和柱，從家蠶中純化天然的BmTnC，為研究該天然蛋白的功能活性打下基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果發(fā)表在BBA上。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，CRABP是一種細胞質(zhì)蛋白，用atRA處理細胞后CRABP仍存在于細胞質(zhì)中。（b）家蠶胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白的表達和功能分析胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白(cellular retinoic acid binding protein, CRABP)是胞內(nèi)脂結(jié)合蛋白的一種，與維甲酸(retinoic acid, RA)的生物學(xué)功能密切相關(guān)。因而，在重組病毒篩選時，除了根據(jù)傳統(tǒng)的方法外，還可根據(jù)有無多角體來判斷重組病毒。通過提取，2D電泳，質(zhì)譜分析，65％以上的蛋白為膜蛋白，說明我們建立了一種全新的膜分離和膜蛋白分離的技術(shù)?；诖?，我們以線形化可救活家蠶核型多角體病毒為對象，構(gòu)建了融