[基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)]核酸疫苗及免疫研究進展(存儲版)
【正文】 端連接 和 平末端連接 兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。主題： DNA疫苗：疫苗學(xué)的新時代。 ? 1993年 Ulmer等將注射技術(shù)用于研究流感核酸疫苗，證實核酸注射不但能在體內(nèi)表達抗原蛋白，還可以誘導(dǎo)具有顯著保護作用的免疫應(yīng)答。 將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為 第二代疫苗 。故基因疫苗應(yīng)運而生。WHO主辦。 定義 核酸疫苗 (nucleic acid vaccine),也稱基因疫苗 (geic vaccine),是指一類將抗原基因重組到表達載體上的重組質(zhì)粒疫苗，經(jīng) 肌肉注射 或黏膜免疫等方法導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。 轉(zhuǎn)染：將質(zhì)?；蛘咭运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過程。 （ 1）蛋白水平的檢測：免疫沉淀法檢測表達蛋白； Western印跡檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定。黏膜淋巴結(jié)提供了漿細(xì)胞抗體型轉(zhuǎn)化與 Th0細(xì)胞向 Th2細(xì)胞定向分化的微環(huán)境。 可能途徑二 ：重組沙門氏菌引起吞噬它的 APCs 凋亡，凋亡產(chǎn)物（含有目的抗原 / 基因疫苗）被鄰近的 APCs 吞噬。 （一）概 念 （二） DNA疫苗的構(gòu)成： 1. 抗原表達基因 2. 真核細(xì)胞啟動子（如 CMV ） 3. Poly A 終止序列（如來自 SV40 或 BGH基因） 4. 原核細(xì)胞選擇標(biāo)志（如青霉素抗性基因） 5. 增強免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化 CpG二核苷 ) 二、 DNA疫苗載體 1. 裸 DNA疫苗：質(zhì)粒、 MIDGE載體 2. 病毒載體： 天花病毒、腺病毒 3. 細(xì)菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細(xì)菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細(xì)胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗 4. 微粒包裹載體：金顆粒 (gold particle)、脂質(zhì)體 (liposomes)、聚丙交酯 聚乙交酯（ PLGA）、藻酸鹽微粒 (alginate)、和納米微粒 (nanoparticles) Various methods of gene delivery 三、 DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 抗原類型 內(nèi)源性 內(nèi)源性 外源性 APC加工過程 蛋白酶體 蛋白酶體 溶酶體 體液免疫應(yīng)答 B細(xì)胞 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 主要的 IgG類別 IgG2a IgG2a IgG1 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 細(xì)胞免疫應(yīng)答 CD4＋ ＋＋＋ Th ＋ /－ Th1 ＋ /－ Th1 CD8＋ ＋＋ ＋＋＋ － 抗原提呈 Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/Ⅱ Ⅱ 免疫記憶 體液免疫 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 細(xì)胞免疫 ＋＋ ＋＋＋ ＋ /－ 參與細(xì)胞因子 IL2, 4， IFNγ, TNFβ IL2,IFNγ,TNF β IL4， 5，10,13 DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 1） DNA疫苗 減毒活疫苗 滅活疫苗 /蛋白亞單位 效應(yīng)機制 CTL CTL 中和反應(yīng) 激活補體 ADCC效應(yīng) 制備 易于構(gòu)建、生產(chǎn) ＋＋＋＋ ＋ ＋＋ 費用 ＋＋＋ ＋ ＋ 運輸 /存儲 ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ 安全性 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較 (續(xù) 2） 核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢 ： (1)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答 ， 其保護性免疫應(yīng)答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用； (2)無減毒 、 滅活疫苗可能引起的致病作用 ， 具有可靠的安全性； (3)能表達經(jīng)修飾的天然抗原 ， 具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性； (4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性； (5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個質(zhì)粒中 ， 或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用 ， 制備多價核酸疫苗； (6)核酸疫苗既有預(yù)防作用 ， 也有治療作用； (7)生產(chǎn)簡便 ， 成本低廉 ， 穩(wěn)定性好 ， 貯運方便 。 重組的 NP作為包被物 ， 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG為二抗 ELISA法檢測血清的抗 NP抗體 血清抗 NP抗體滴度的測定 : 將初次免疫后 42天的免疫鼠眼球取血 N=6/group 留置血清 ， 以 10倍稀釋為起點 ,再做系列稀釋 ELISA法 檢測血清抗體滴度 六 、 核酸疫苗的優(yōu)化 免疫效果的優(yōu)化 選擇高效表達載體 添加 DNA免疫激活序列 免疫途徑的優(yōu)化 肌肉注射（ im） 基因槍導(dǎo)入 皮內(nèi) (id)和皮下 (sc)注射 黏膜表面接種 Effects of CpG motifs on various cells Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs 免疫途徑的優(yōu)化 基因佐劑 的應(yīng)用 細(xì)胞因子類 共刺激分子 分子佐劑聯(lián)合 抗原蛋白的泛素化表達 IL1 IL1 IL18及 IFNγ以增強 Th1型細(xì)胞應(yīng)答為主 。 ? 免疫 2天的小鼠產(chǎn)生耐受 ? 免疫出生 24小時內(nèi)的小鼠 ， 與在成年小鼠中觀察到的沒有區(qū)別 。 八、 DNA疫苗的應(yīng)用 （一）感染性疾病 （二）腫瘤 （三）自身免疫病與變態(tài)反應(yīng) 表 病毒的 DNA疫苗 病
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