細(xì)胞生物學(xué)研究方法(存儲版)
【正文】 三 細(xì)胞拆合及顯微操作技術(shù) 細(xì)胞拆合方法： 可以分為物理法和化學(xué)法兩種類型 。hler 德國 巴塞爾免疫研究所 1946年 1995年 米爾斯坦 C233。 （一） 細(xì)胞融合的概念 細(xì)胞融合（ cell fusion）又稱細(xì)胞雜交（ cell hybridization）是指在自然條件下或人工方法（物理，化學(xué)，生物等方法）將不同種生物或同種生物不同類型兩個或多個真核細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的生物學(xué)現(xiàn)象和過程。 如果細(xì)胞能連續(xù)傳代培養(yǎng)的，稱為連續(xù)細(xì)胞系（ continuous cell line）。 一 細(xì) 胞 培 養(yǎng) （一） 動物細(xì)胞培養(yǎng) （二） 植物細(xì)胞培養(yǎng) 第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng) 、 細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng) 就是將動植物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個細(xì)胞或直接以單細(xì)胞 生物，給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與增殖。下面介紹二種細(xì)胞化學(xué)的定量分析方法。 （ 2）免疫電鏡技術(shù) 體外培養(yǎng)的 BHK21細(xì)胞經(jīng)選擇性抽提后用抗 280kD核骨架蛋白抗體進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記的結(jié)果 IF： 中間纖維； g： 金顆粒； N： 核區(qū)。 當(dāng)用免疫球蛋白包被膠體金后則稱為免疫金 ， 是一種在光鏡或電鏡下易辨認(rèn)的標(biāo)記物 。 ?間接法 ?直接法 將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng) ，顯示出抗原存在的部位 在抗體抗原初級反應(yīng)的基礎(chǔ)上 ， 再用帶標(biāo)記的次級抗體與初級抗體反應(yīng) ， 從而使初級反應(yīng)得到放大 ， 增強(qiáng)顯示效果 Antigen presenting Cell Enzymeconjugated Primary Antibody Substratechromogen solution ?直接法 將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng) ，顯示出抗原存在的部位 間接免疫細(xì)胞化學(xué)法的原理示意圖 次級 抗體 初級 抗體 標(biāo)記物 第一抗體（一抗） 第二抗體（二抗） Primary Antibody Enzymeconjugated Secondary Antibody Antigen presenting Cell Substratechromogen solution 間接法 （一）免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 就是將免疫學(xué)方法 （ 抗原抗體特異結(jié)合 ） 與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法 。 Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi apparatus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electrondense precipitate upon reaction with the enzyme 脂類物質(zhì)包括脂肪和類脂。 ?常用介質(zhì)： 氯化銫 、 蔗糖 、 多聚蔗糖 。 1924年 svdberg發(fā)明了世界上第一臺分析超速離心機(jī)。 掃描隧道顯微鏡原理 示意圖 探針和物體之間加上電壓。 噴金 , 90176。 分辨率 。這種切片需要用超薄切片機(jī)制作。目前像基因注入、核移植等生物工程的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。 WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY ?The resolution of images obtained with conventional microscopy are seriously deteriorated by the contamination of the image plane with outoffocus light WIDEFIELD CONFOCAL 共聚焦掃描顯微鏡的成像基本原理 分辨率可以比普通熒光顯微鏡的分辨率提高 ～ 由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響 conventional confocal 可獲取連續(xù)光學(xué)切片 優(yōu)點(diǎn)： 多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物 LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) 2022年的諾貝爾化學(xué)獎授予了從事有關(guān)“綠色熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) ,表達(dá)和發(fā)展”并取得重要成就的三位科學(xué)家 :下村修、馬丁 誘發(fā)熒光 :一些細(xì)胞成分本身經(jīng)紫外線照射后不發(fā)熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進(jìn)行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。 常用固定劑： 甲醛、戊二醛、乙醇 ② 包埋： 便于切片，防止樣品移位 ,常用包埋劑：石蠟 ③ 切片： 生物樣品太厚，不能直接用光鏡觀察，需切成 1～10μ m的薄片 ④ 染色 : 蘇木精－ 對負(fù)電荷分子有親和力，可顯示細(xì)胞內(nèi)核酸的分布 伊 紅 －可使細(xì)胞質(zhì)染色 光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察 蘇木精 伊紅染色 ，又稱“蘇木素 伊紅染色”，或“ Hamp。 放大倍數(shù) ＝ 目鏡 的放大倍數(shù) X物鏡 的放大倍數(shù) 人眼的分辨能力在 mm左右 ① 固定： 可使生物大分子交聯(lián)，蛋白質(zhì)成分凝固，防止細(xì)胞自溶和破壞而產(chǎn)生人工假象。 特點(diǎn)： 光源為紫外線 ， 波長較 短 ， 分辨力高于普通顯微鏡； 自發(fā)熒光 :由細(xì)胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線照射所發(fā)出的熒光。 放大 1600倍的人類精子細(xì)胞 （三）激光共聚焦掃描顯微 鏡 是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像的一種光學(xué)顯微鏡。 DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色） 微分干涉差顯微鏡的應(yīng)用： (Differentialinterference microscope)DIC顯微鏡使細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。 由于電子束穿透力很弱，因此用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅 20－ 50nm 的超薄切片，并放在銅網(wǎng)上。 透射電鏡標(biāo)本制備過程 : 觀察組織、細(xì)胞 內(nèi)部超微結(jié)構(gòu) 。 ③ 標(biāo)本蝕刻后， 再向斷裂上以 45176。 掃描電子顯微鏡 生物
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