細(xì)胞生物學(xué)研究方法-免費(fèi)閱讀
【正文】 細(xì)胞拆合： 就是把核與質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，然后把不同來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。 細(xì)胞 DNA合成一般有兩條途徑 : HAT培養(yǎng)基篩選 : H, 次黃嘌呤 。如皰疹病毒，牛痘病毒，雞瘟病毒和仙臺(tái)病毒等．其中常用的是經(jīng)紫外線照射滅活的仙臺(tái)病毒． 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法 仙臺(tái)病毒 紫外線 喪失感染活性 （不感染細(xì)胞 ） 保留融合活性 （誘導(dǎo)細(xì)胞融合） ３ . 電激介導(dǎo)的細(xì)胞融合 其中電誘導(dǎo)細(xì)胞融合和ＰＥＧ誘導(dǎo)細(xì)胞融合是動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法。所謂 轉(zhuǎn)化 即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。 如轉(zhuǎn)基因、基因敲除、被標(biāo)記等 。 一 顯微分光光度測(cè)定技術(shù) 二 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)是用流式細(xì)胞儀分離篩選細(xì)胞或測(cè)定細(xì)胞組分的一 種技術(shù) 由細(xì)胞流動(dòng)室、光源（激光）、信號(hào)檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)分析處理 系統(tǒng)四部分組成 用途： 對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 快速定量分析與分選 。 利用這樣的特性 ， 用放射性化合物脈沖標(biāo)記活細(xì)胞 ,經(jīng)固定 、 切片后在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上 ,在此期間 ,由于放射性同位素衰變使乳膠曝光 ,經(jīng)顯影 、 定影 ,根據(jù)銀粒所在部位 ,就可知道細(xì)胞中放射性物質(zhì)的分布 。 免疫電鏡技術(shù)中 最關(guān)鍵的問(wèn)題同樣是保持樣品中蛋白的抗原性 ， 并且要設(shè)立嚴(yán)格的對(duì)照 。標(biāo)本處理有多種方法，組織切片、冰凍切片都可應(yīng)用，其宗旨只有一個(gè)， 即要盡量完好地保持被檢測(cè)蛋白的抗原性 ；免疫染色就是抗原抗體反應(yīng)的過(guò)程，這里要注意設(shè)立各種實(shí)驗(yàn)對(duì)照以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 與免疫電鏡是最常見(jiàn)的研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位的重要技術(shù) 。 Schiff試劑中的 無(wú)色品紅 與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物，醌基為發(fā)色團(tuán)，呈現(xiàn)出紫紅色。 差速離心 低速離心 中速離心 高速離心 超高速離心 細(xì)胞勻漿 細(xì)胞 核仁 細(xì)胞骨架 大細(xì)胞器 小細(xì)胞器 核糖體 大分子 等密度離心法： 按細(xì)胞組分的浮力密度不同進(jìn)行分離的方法。 可在真空 、 大氣 、 常溫等不同環(huán)境下工作 ， 甚至可將樣品浸在水和其它溶液中 ， 不需要特別的制樣技術(shù) ， 并且探測(cè)過(guò)程對(duì)樣品無(wú)損傷 。 ? 分辨力為 6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為 ，掃描電鏡的有效放大倍率為 20220X。 三 冰凍蝕刻技術(shù) ① 將標(biāo)本于 100℃ 干冰中或 196℃ 液氮中，超低溫冰凍。 染色 :生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成 , 散射電子能力弱 , 無(wú)明暗反差 ,需進(jìn)行染色。 電鏡的分辨本領(lǐng) : 是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率 。 與相差顯微鏡相比 ， 其標(biāo)本可略厚一點(diǎn) ， 折射率差別更大 ， 故影像的立體感更強(qiáng) 。 蠑螈肺細(xì)胞的有絲分裂 (240x), 熒光。 嗜酸 性結(jié)構(gòu)則通常由細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的 蛋白質(zhì) ，如路易體（ Lewy body）、酒精小體（ Mallory body）、細(xì)胞質(zhì)的大部分等。 ?構(gòu)成： （ 1）光學(xué)放大系統(tǒng) : （ 2）照明系統(tǒng)： （ 3）機(jī)械和支架系統(tǒng) ?原理： 經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像， 經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。 這種染色方法的基礎(chǔ)是組織結(jié)構(gòu)對(duì)不同染料的結(jié)合程度不同。 即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。 綠色熒光蛋白改造的蜜蜂 相差顯微鏡 （ phasecontrast microscope） 是一種將光線通過(guò)透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)生的光程差 （ 即相位差 ） 轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡 。將微分干涉顯微鏡接上錄像機(jī)，可以觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。 脫水 :等級(jí)梯度脫水，用脫水有利包埋。 電子密度高、電子密度低 ：被重金屬浸染呈黑色的結(jié)構(gòu)，稱電子密度高；反之，淺染的部分稱電子密度 用 重金屬鹽 （如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品 進(jìn)行 染色 ；吸去染料，樣品干燥后，樣品 凹陷處 和 樣品周圍 鋪 了一薄層重金屬鹽，而 凸出處 則沒(méi)有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染 效果，分辨力可達(dá) 。 ④ 復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài) ， 撈于載網(wǎng)上干燥后可置于透射電鏡下觀察 。如果探針與物體的距離發(fā)生變化，這股電流也會(huì)相應(yīng)的改變。 一般步驟 ： 勻漿化 離心處理 收集分析 （一）差速離心 Differential centrifugation ? 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器 。 ? 利用這種方法對(duì)細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括糖類、脂類、核酸、酶等。多用蘇丹染料、油紅 O、尼羅藍(lán)等溶于脂類的染料染色，使脂質(zhì)呈色。 實(shí)質(zhì) 就是用結(jié)合有 熒光素 的抗體與組織內(nèi)抗原反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。 也可以先用一種抗體 （ 第一抗體 ） 結(jié)合到抗原部位然后用可以識(shí)別第一抗體 。 原位雜交技術(shù)首先是在光鏡水平上發(fā)展起來(lái)的， 放射性同位素 標(biāo)記的探針與樣品中的 DNA或 RNA雜交后，用顯微放射自顯影的方法顯示雜交物的存在部位；或用 熒光素 標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，在熒光顯微鏡下直接顯示與探針雜交的核酸存在部位。 根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性 ， 可利用細(xì)胞分光光度計(jì)對(duì)一定的成分進(jìn)行定位 、 定性測(cè)定 。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 細(xì)胞系 （ cell line） : 當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞分裂增殖相互間密切接觸時(shí)，細(xì)胞停止活動(dòng)的現(xiàn)象為接觸抑制。 兩個(gè)細(xì)胞正在融合 細(xì)胞膜的流動(dòng)性是動(dòng)物細(xì)胞融合的生物學(xué)基礎(chǔ)。 脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞 ) 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 分泌抗體 長(zhǎng)命 分泌抗體 短命 長(zhǎng)命 不分泌抗體 （二） HAT培養(yǎng)基篩選 的原理 免疫脾細(xì)胞 經(jīng)抗原免疫的 BALB/c小鼠的脾臟 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶（ TK） － 缺陷型 親本細(xì)胞 主途徑：是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA， 葉酸 作為重要的輔酶參與這一合成過(guò)程。 這種核移植必須用顯微操縱儀進(jìn)行操作 。 顯微操作儀 現(xiàn)在顯微操作裝置的設(shè)計(jì)越來(lái)越精密，已經(jīng)有可能對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行解剖和注入微量物質(zhì)（如核酸分子片段）。 脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞 ) 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞 /?脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 / ?骨髓瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞 不能長(zhǎng)期存活 不能長(zhǎng)期存活 單克隆抗體制備示意圖
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