細胞生物學(xué)研究方法-預(yù)覽頁
【正文】 實像， 經(jīng)目鏡進一步放大成像。E染色 ”（ hematoxylin and eosin stain、HE stain），是組織學(xué)最常用的染色方法之一。 嗜酸 性結(jié)構(gòu)則通常由細胞內(nèi)及細胞間的 蛋白質(zhì) ，如路易體（ Lewy body）、酒精小體（ Mallory body）、細胞質(zhì)的大部分等。 什么是熒光？ 當(dāng)一個物體吸收了紫外光（短波光）的能量，物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出比原來吸收的波長更長的光為“熒光”。 蠑螈肺細胞的有絲分裂 (240x), 熒光。查爾菲和錢永健。 與相差顯微鏡相比 ， 其標(biāo)本可略厚一點 ， 折射率差別更大 ， 故影像的立體感更強 。 微分干涉顯微鏡還可用于研究活細胞中較大的細胞器。 電鏡的分辨本領(lǐng) : 是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率 。 1. 超薄切片技術(shù) 二、主要電鏡制樣技術(shù)： 超薄切片 銅網(wǎng) 取材 :要快，避免損傷，標(biāo)本必須薄，小 固定 :常用戊二醛和四氧化鋨固定，四氧化鋨除與蛋白共價結(jié)合外 ,還對脂類有良好的固定效果。 染色 :生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成 , 散射電子能力弱 , 無明暗反差 ,需進行染色。 標(biāo)本在熒光屏上呈黑白反差的結(jié)構(gòu)影像。 三 冰凍蝕刻技術(shù) ① 將標(biāo)本于 100℃ 干冰中或 196℃ 液氮中，超低溫冰凍。 噴碳后 將樣品浸泡于腐蝕液中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑－碳復(fù)型膜。 ? 分辨力為 6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為 ，掃描電鏡的有效放大倍率為 20220X。如果探針距離物體表面很近 —— 大約在納米級的距離上電子會穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。 可在真空 、 大氣 、 常溫等不同環(huán)境下工作 ， 甚至可將樣品浸在水和其它溶液中 ， 不需要特別的制樣技術(shù) ， 并且探測過程對樣品無損傷 。 離心機： 普通： 8000rpm以下； 高速： 8000~25000rpm； 超速： 25000rpm以上，達十幾萬 rpm。 差速離心 低速離心 中速離心 高速離心 超高速離心 細胞勻漿 細胞 核仁 細胞骨架 大細胞器 小細胞器 核糖體 大分子 等密度離心法： 按細胞組分的浮力密度不同進行分離的方法。 密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體 CsCl 密度梯度離心分離 DNA 密度大于 ? 原理： 利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征 ， 通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量 。 Schiff試劑中的 無色品紅 與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物，醌基為發(fā)色團，呈現(xiàn)出紫紅色。標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。 免疫細胞化學(xué)技術(shù) 與免疫電鏡是最常見的研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位的重要技術(shù) 。 常用的螢光素有異硫氰酸熒光素 (FITC)、 羅丹明 (rhodamine)等 。標(biāo)本處理有多種方法，組織切片、冰凍切片都可應(yīng)用，其宗旨只有一個， 即要盡量完好地保持被檢測蛋白的抗原性 ；免疫染色就是抗原抗體反應(yīng)的過程，這里要注意設(shè)立各種實驗對照以檢驗結(jié)果的可靠性。 膠體金可以直接與抗體連接形成免疫金 ， 導(dǎo)至抗原部位 ， 稱為直接免疫法 。 免疫電鏡技術(shù)中 最關(guān)鍵的問題同樣是保持樣品中蛋白的抗原性 ， 并且要設(shè)立嚴(yán)格的對照 。 核酸雜交原理 原位雜交 (in situ hybridization)： 在不破壞細胞或細胞器的情況下，用核酸探針檢測特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術(shù)，稱為原位雜交(in situ hybridization)。 利用這樣的特性 ， 用放射性化合物脈沖標(biāo)記活細胞 ,經(jīng)固定 、 切片后在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上 ,在此期間 ,由于放射性同位素衰變使乳膠曝光 ,經(jīng)顯影 、 定影 ,根據(jù)銀粒所在部位 ,就可知道細胞中放射性物質(zhì)的分布 。 顯微分光光度測定技術(shù) 流式細胞術(shù) 細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜 ， 核酸 (260nm)、 蛋白質(zhì) (280nm)、 細胞色素 、 維生素等都有自己特征性的吸收曲線 。 一 顯微分光光度測定技術(shù) 二 流式細胞術(shù) 流式細胞術(shù)是用流式細胞儀分離篩選細胞或測定細胞組分的一 種技術(shù) 由細胞流動室、光源（激光）、信號檢測器、計算機分析處理 系統(tǒng)四部分組成 用途： 對單個細胞進行 快速定量分析與分選 。 是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。 如轉(zhuǎn)基因、基因敲除、被標(biāo)記等 。 如果細胞能無限傳代培養(yǎng)，稱為永生化細胞系（ immortal cell line）。所謂 轉(zhuǎn)化 即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。 細 胞 融 合 同核融合細胞 ： 基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體 (homokaryon)； 異核融合細胞 ： 來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體 (heterokaryon)。如皰疹病毒，牛痘病毒，雞瘟病毒和仙臺病毒等．其中常用的是經(jīng)紫外線照射滅活的仙臺病毒． 誘導(dǎo)細胞融合的方法 仙臺病毒 紫外線 喪失感染活性 （不感染細胞 ） 保留融合活性 （誘導(dǎo)細胞融合） ３ . 電激介導(dǎo)的細胞融合 其中電誘導(dǎo)細胞融合和ＰＥＧ誘導(dǎo)細胞融合是動物細胞融合的常用方法。sar Milstein 英國 英國醫(yī)學(xué)研究委員會 分子生物實驗室 1927年 三 . 單克隆抗體的概念和原理 由單一克隆的 雜交瘤細胞 分泌的抗體，只針對于一個抗原決 定簇 —— 單克隆抗體 抗原分子表面具有特殊立體構(gòu)型和免疫活性的化學(xué)基團稱為抗原決定簇。 細胞 DNA合成一般有兩條途徑 : HAT培養(yǎng)基篩選 : H, 次黃嘌呤 。 物理法 ：用機械方法或短波光把細胞核去掉或失 活 ， 然后用微吸管吸取其它細胞的核 ， 注入去核的細胞質(zhì)中 ， 組成新的雜交細胞 。 細胞拆合： 就是把核與質(zhì)分離開來，然后把不同來源的細胞質(zhì)和細胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細胞。 注射吸管 固定吸管 DNA 思考題： 1. 如何分離分析細胞組分？ 2. 什么是原位雜交？ 3. 單克隆抗體技術(shù)原理？ 4. 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、 5. 細胞系、細胞株、細胞融合（細胞雜交）
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