【正文】 5．制備PCC標(biāo)本 細(xì)胞溫育后，1000rpm離心5分鐘棄去上清，加入10ml ／L KCl低滲液輕輕制成懸液。 3．50％PEG的制備 PEG(MW4,000)，倒入離心管中，在酒精燈上加熱使之融化()，放在37℃水浴中待用。這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于細(xì)胞周期分析、正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞染色體的微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究、多種因素作用細(xì)胞使染色體損傷及修復(fù)效應(yīng)的研究，預(yù)測(cè)某種血液病的病程、愈后及復(fù)發(fā)的臨床實(shí)踐等方面。公式如下： 【作 業(yè)】l．在顯微鏡下按順序繪制所觀察到的細(xì)胞融合各階段，并注明主要特點(diǎn)。 (4)取上述50％，在1分鐘內(nèi)滴加到雞紅細(xì)胞懸液，邊加邊輕輕搖動(dòng)混勻。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。染色體分組形態(tài)特征表 第五確定E組：E組三對(duì)即第16～18號(hào)6條染色體，較小，第16號(hào)是中央著絲點(diǎn)，118號(hào)是亞中著絲點(diǎn)。人體染色體的常規(guī)核型即按照Denver會(huì)議(1960年)提出的染色體命名和分類標(biāo)準(zhǔn)，將人類體細(xì)胞的46條染色體按大小、著絲點(diǎn)的位置分成七組(A、B、C、D、E、F、G、)23對(duì)的排列。以下步驟同淋巴細(xì)胞染色體核型制備。腫瘤細(xì)胞染色體異常包括兩個(gè)方面： 1．結(jié)構(gòu)異常 即在腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)的染色體畸變，包括雙著絲點(diǎn)染色體、環(huán)狀染色體、斷裂的染色體、染色體裂隙及微小體等。再離心，～，吹打成細(xì)胞懸液。 (二)操作 1．微量全血細(xì)胞培養(yǎng)至68小時(shí)左右，用1ml注射器 號(hào)針頭向每個(gè)5ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加2滴秋水仙素溶液，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，此項(xiàng)操作不需要嚴(yán)格無(wú)菌。 3．用5ml注射器，7號(hào)針頭，先吸取少許肝素濕潤(rùn)針筒，然后從肘靜脈抽血l～2ml。此法采血量少、操作簡(jiǎn)便，在 PHA作用下進(jìn)行短期培養(yǎng)即可獲豐富的、有絲分裂活躍的淋巴母細(xì)胞，適于制備核型標(biāo)本?！緦?shí)驗(yàn)用品】 一、材料和標(biāo)本 健康人的外周血、培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞和HL—60細(xì)胞。 (3)后期Ⅱ(AnaphaseⅡ)著絲?？v裂，每條染色體的兩條單體彼此分離，各成一子染色體，分別移向兩極。這時(shí)的染色體組居細(xì)胞中央，側(cè)面觀呈板狀，極面觀呈空心花狀。 2．減數(shù)分裂I(Meiotic division I) 減數(shù)分裂l是從初級(jí)精母細(xì)胞到次級(jí)精母細(xì)胞的一次分裂。在公園、田埂、河邊、路旁的草叢中均可采到。圖9—2 洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂 后期(Anaphase)紡錘絲變短，縱裂后的染色體被分離為兩組，分別移向細(xì)胞兩極，細(xì)胞膜開始凹陷。 (二)觀察 1．動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂的觀察——馬蛔蟲子宮切片取馬蛔蟲的子宮切片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察，可見馬蛔蟲子宮腔內(nèi)有許多橢圓形的受精卵細(xì)胞，它們均處在不同的細(xì)胞時(shí)相。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 細(xì)胞分裂對(duì)生物的個(gè)體發(fā)育和生存，對(duì)種族綿延有著十分重要的意義，高等生物體內(nèi)細(xì)胞的分裂方式有三種：無(wú)絲分裂、有絲分裂和減數(shù)分裂。 3．取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記④、⑤涂片)，％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。 2．將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，／／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、原理 細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。 11．脫水：95％乙醇3分鐘二次→100％乙醇3分鐘二次→二甲苯透明10分鐘二次。 3．用70％乙醇展片。5．清水沖洗，放入1％番紅溶液中復(fù)染2分鐘。7．清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同pH值的固綠染液分別染色，細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來(lái)。 5．取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗2～3次(2～3秒鐘左右)，吸去水分。 三、試劑PBS緩沖液()、甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液、純丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、純二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、％堿性固綠、％酸性固綠、％硫酸銅、聯(lián)苯胺混合液、1％番紅、無(wú)水乙醇、過(guò)碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亞硫酸水、Ehrlieh蘇木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，體積比)【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 細(xì)胞的組織化學(xué)方法，是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。加蓋玻片，制成臨時(shí)裝片。蟲體由一個(gè)細(xì)胞組成，能執(zhí)行復(fù)雜的生理功能。 2．換高倍鏡仔細(xì)觀察纖毛有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)。注：如果使用高倍鏡觀察標(biāo)本時(shí)，應(yīng)按高倍鏡調(diào)焦的視野大小重新制作中央遮光板。常常用它來(lái)觀察沒(méi)有染色的活體細(xì)胞或膠體粒子。吞噬細(xì)胞主要靠吞噬來(lái)處理異物。【實(shí)驗(yàn)用品】 一、材料和標(biāo)本 雄性蟾蜍、小白鼠、l％雞血懸液、6％淀粉肉湯、草履蟲。中央有圓形的細(xì)胞核，核膜密布核孔，核膜內(nèi)側(cè)少量著色深而致密的是異染色質(zhì)，色淺的是常染色質(zhì)。溶酶體呈球形，質(zhì)地均勻，吞噬性溶酶體依結(jié)合物不同而呈不同形態(tài)，溶酶體主要含酸性水解酶。扁平囊約3～8層，它們平行排列，略彎曲成弓形。在核的周圍有黑褐色顆粒狀或呈不規(guī)則的條索狀結(jié)構(gòu)即為高爾基復(fù)合體。 4．洗去藥物，再觀察?？拷号菔且粚尤苣z樣流動(dòng)的內(nèi)質(zhì)，在內(nèi)質(zhì)與質(zhì)膜之間，為靜止的外質(zhì)，其中含有葉綠體。③立刻將蓋片移入M一緩沖液，換洗三次，每次3分鐘。細(xì)胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動(dòng)蛋白結(jié)合，從而破壞微絲，改變細(xì)胞的形狀。 二、大白鼠脛骺軟骨細(xì)胞電鏡照片的觀察 動(dòng)物細(xì)胞液泡很小，即使是活體染色也只能看出是一個(gè)小點(diǎn)，為了進(jìn)一步看清液泡的結(jié)構(gòu)我們有必要觀察軟骨細(xì)胞的電鏡照片?！緦?shí)驗(yàn)用品】一、 材料和標(biāo)本 蟾蜍一只，軟骨細(xì)胞電鏡照片。脊的橫切面呈囊狀或管狀。 將稍大的組織塊去掉，使游離的細(xì)胞或細(xì)胞群留在載片上，加一滴Ringer氏液，蓋上蓋片，吸去多余水分?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、兔肝細(xì)胞線粒體的活體染色 （一）原理 線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。 (二)方法 1．將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上夾好，小心轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺和移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺使兩尺平行，記錄鏡臺(tái)測(cè)微尺若干格所對(duì)應(yīng)的目鏡測(cè)微尺的格數(shù)(圖1—2)。自細(xì)胞數(shù)目少，為圓形。 4．蟾蜍血涂片的制備與觀察 取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在載片上．將另一載片的一端呈45176。染成蘭紫色的、大的、有多個(gè)突起的細(xì)胞是脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個(gè)圓形細(xì)胞核，內(nèi)有一個(gè)核仁(參照照片)。但也有例外。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當(dāng)并注意紙面的整潔。 4．眼科剪刀：用于剪斷神經(jīng)、血管、筋膜等細(xì)軟組織。～／10克體重。常用的方法有頸椎脫位法，斷頭法和二氧化碳吸入法等。具體方法是，左手握住蟾蜍的身體和四肢，使其腹部貼著掌心，食指壓住蟾蜍頭部前端使其盡量腹屈。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的了解和解剖器械的使用 一、常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、貓、兔和狗等。如遇儀器損壞或不靈，應(yīng)及時(shí)報(bào)告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。 目 錄前 言 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則……………………………………………………………… (1) 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物了解和解剖器械的使用………………………………… (2) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)繪圖方法與要求………………………………………（4）實(shí)驗(yàn) 一 動(dòng)物細(xì)胞的基本形態(tài)觀察和顯微測(cè)量…………………………………（5）實(shí)驗(yàn) 二 線粒體的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（8）實(shí)驗(yàn) 三 液泡系的活體染色及電鏡照片觀察……………………………………（10）實(shí)驗(yàn) 四 細(xì)胞中微絲的染色及微絲與細(xì)胞形態(tài)的實(shí)驗(yàn)觀察…………………… (11)實(shí)驗(yàn) 五 細(xì)胞器的光鏡切片和電鏡照片觀察……………………………………（13）實(shí)驗(yàn) 六 細(xì)胞生理活動(dòng)的觀察……………………………………………………（16）實(shí)驗(yàn) 七 細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)……………………………………………………（20）實(shí)驗(yàn) 八 細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離……………………………………………（23）實(shí)驗(yàn) 九 細(xì)胞分裂的形態(tài)觀察……………………………………………………（26）實(shí)驗(yàn) 十 正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備…………………………… (31)實(shí)驗(yàn)十一 細(xì)胞融合…………………………………………………………………（36）實(shí)驗(yàn)十二 應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本…………………………（38）實(shí)驗(yàn)十三 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)……………………………………………（40）實(shí)驗(yàn)十四 細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)…………………………………………………（43）實(shí)驗(yàn)十五 酸性磷酸酶的顯示………………………………………………………（46）實(shí)驗(yàn)十六 腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)和測(cè)定……………………………………（48）實(shí)驗(yàn)十七 電鏡生物標(biāo)本的制備及鏡下觀察………………………………………（50）實(shí)驗(yàn)十八 整裝培養(yǎng)細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的光鏡和透射電鏡標(biāo)本制備與觀察………（54）實(shí)驗(yàn)十九 免疫熒光抗體法檢查細(xì)胞表面抗原……………………………………（56）實(shí)驗(yàn)二十 姊妹染色單體互換標(biāo)本制備與分析……………………………………（58）實(shí)驗(yàn)二十一 銀染核仁形成區(qū)的光鏡和電鏡標(biāo)本制備及觀察…………………… (60)實(shí)驗(yàn)二十二 染色體掃描電鏡標(biāo)本制備及觀察……………………………………（63）實(shí)驗(yàn)二十三 細(xì)胞顯微攝影…………………………………………………………（65） 附錄一 離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)與離心力的換算表………………………………（67） 附錄二 溶液的配制……………………………………………………（68） 主要參考資料……………………………………………………………（77）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 一、遵守實(shí)驗(yàn)紀(jì)律，按時(shí)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不得遲到或早退。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用生活細(xì)胞材料，由學(xué)生自己動(dòng)手取材和實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生能對(duì)細(xì)胞獲得生動(dòng)的認(rèn)識(shí)。選編了一些生物醫(yī)學(xué)常用的細(xì)胞生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞的顯微測(cè)量、細(xì)胞活力測(cè)定、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞組分的分級(jí)分離、細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞生理活動(dòng)、細(xì)胞染色體技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、免疫熒光技術(shù)、電鏡技術(shù)等，為后續(xù)的課程及醫(yī)學(xué)研究打下一定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中途因故需外出時(shí)應(yīng)向任 課教師請(qǐng)假。 損壞器材或設(shè)備者應(yīng)按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行賠償。在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常常根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩x用不同的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。在頭與軀干之間可觸及一凹陷(即枕骨大孔所在處)，右手持解剖針直插入此凹陷約l～2mm，隨即將針尖轉(zhuǎn)向頭側(cè)插入顱腔搗毀腦組織。斷頭法需用特殊的斷頭器，二氧化碳吸入法則將小鼠放入盛有二氧化碳的容器內(nèi)即可。 二、常用手術(shù)器械及操作方法： 1．解剖針：用于挑、刺等。 5．眼科鑷子：用于提取神經(jīng)、血管和筋膜等細(xì)軟組織。實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞的基本形態(tài)觀察和顯微測(cè)量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 制備不同細(xì)胞的臨時(shí)制片，觀察、了解細(xì)胞的基本形態(tài)，學(xué)會(huì)使用測(cè)微尺，通過(guò)測(cè)量對(duì)紅細(xì)胞的進(jìn)化進(jìn)行分析。例如：哺乳類紅細(xì)胞成熟時(shí)細(xì)胞核消失。 2．蟾蜍骨骼肌細(xì)胞的剝離與觀察 剪開蟾蜍腿部皮膚，剪下一小塊肌肉，放在載片上，用鑷子和解剖針剝離肌肉塊成為肌束，繼續(xù)剝離，可得到很細(xì)的肌纖維(肌細(xì)胞)。角緊貼在血滴的前緣，均勻用力向前推，使血液在載片上形成均勻的薄層。 6．人口腔上皮細(xì)胞標(biāo)本的制備與觀察 用牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞均勻地涂在載片上(不可反復(fù)涂沫)，滴一滴甲苯胺蘭染液，染色5分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。2．按下式求出目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度 目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度(μm)=X10 三、測(cè)量人口腔上皮細(xì)胞 從顯微鏡載物臺(tái)上取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上人口腔上皮細(xì)胞標(biāo)本，測(cè)量細(xì)胞、細(xì)胞核的長(zhǎng)短徑。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量，主要是通過(guò)線粒體呼吸作用來(lái)提供的。 (三)結(jié)果 顯微鏡觀察，肝細(xì)胞質(zhì)中許多線粒體被染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀。脊的數(shù)量與細(xì)胞呼吸機(jī)能的強(qiáng)度有很大關(guān)系。二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡一臺(tái)、手術(shù)器材一套、解剖盤一個(gè)、載片、蓋片、吸水紙。 大白鼠脛骺骨細(xì)胞電鏡照片，細(xì)胞核與核仁很清楚，細(xì)胞質(zhì)中有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，液泡系發(fā)達(dá)，液泡由單層膜包圍，細(xì)胞周邊有液泡釋放。(二)細(xì)胞松馳素B處理成纖維細(xì)胞與染色觀察1．在平皿中有三張成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的蓋片，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將一張蓋片移入另一皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用作對(duì)照。M一緩沖液有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。內(nèi)質(zhì)中含有許多顆粒，可以清楚地看到胞質(zhì)環(huán)流。 (三)結(jié)果 在麗藻內(nèi)質(zhì)中可以看到胞質(zhì)環(huán)流，用細(xì)胞松弛素B處理后，胞質(zhì)環(huán)流停止，洗去藥物，又出現(xiàn)胞質(zhì)環(huán)流。 圖5一l神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(示高爾基復(fù)合體)(二)尼氏小體(Nissl’s Body)甲苯胺蘭染色的牛脊髓涂片，尼氏小體即光鏡下的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。凸出的一側(cè)為形成面，可見許多小囊泡，凹入的一側(cè)為成熟面，可見扁平囊末端呈球形膨大，在分泌細(xì)胞中膨大部分不斷脫離扁平囊，形成分泌泡。 (五)核糖體(Ribosome)小鼠腎細(xì)胞核糖體電鏡照片：核糖體是由核糖核酸