外源基因的表達ppt課件(存儲版)
【正文】 （ +） 轉錄 翻譯 mRNA 翻譯 阻遏蛋白 蛋白質 誘導劑 控制區(qū) 信息區(qū) 操縱子 （ 2） 真核生物基因表達系統(tǒng) ?轉錄 是在 核內 進行的，先生成 hnRNA，再加工去掉內含子，外顯子相連接，并修飾 5′和 3′末端后才形成成熟的、有功能的 mRNA。第六章 外源基因的表達 基因重組的 主要目的 使目的基因在某一細胞中能得到高效表達，即 產生人們所需要的高產的目的基因產物 ，如蛋白質、多肽類生物藥物。 ?mRNA只能在 細胞質 中的 核糖體 上 轉譯 成多肽或蛋白質，再經過加工、糖化，形成高級結構。 不具備真核生物的蛋白質加工系統(tǒng)，表達產物無特定的空間構象。 pSC101： 嚴謹復制型 ，每細胞質?？截悢?shù)少于 5個。 （ 2）外源目的基因的轉錄系統(tǒng) 這一系統(tǒng)包括 啟動子、抑制物基因 和 終止子 。 因此，在構建表達載體的時候一般采 用 強的啟動子 和 強的終止子 ，以達到高效表達的目的。 例如： ?起始密碼子與 SD序列之間的距離： 6～ 8bp，多數(shù)為 7bp ?SD序列后面的堿基組成： 為 AAAA或 UUUU時，翻譯起始效率最高；為 CCCC或 GGGG是，翻譯起始效率分別為最高的 50%和 15%。 在大腸桿菌中，合成多肽鏈的釋放由 RF1和 RF2兩個 釋放因子 所調控， RF1識別終止密碼 UAA和UAG， 而 RF2識別終止密碼 UAA和 UGA，由于UAA同時為兩個釋放因子所識別，一般被選作翻譯的終止密碼。 為了使外源基因高效表達，必須構建作為基因表達受體菌的 大腸桿菌工程菌 。 ：包括 DNA、 RNA和脂多糖等。表達的外源蛋白不需經過裂解處理。此外，還必須將可控的表達元件和選擇標記基因連接在一起。 ② 分泌到細胞外周質的蛋白質產物較穩(wěn)定，不易被細胞內蛋白酶所降解。 ?提高外源基因表達產物的穩(wěn)定性。 芽孢桿菌啟動子的表達具有明顯的 時序性 ，它與菌體的生長周期和生理代謝活動密切相關。 ?終止子 具有較長的不完全互補反向重復序列，可形成發(fā)卡結構。 藍藻與真核生物藻類最大的區(qū)別是： 它無葉綠體，無真核，有 70S核糖體，細胞壁中含有肽聚糖，因而對青霉素和溶菌酶十分敏感等。 外源目的基因在藍藻細胞中的表達 在藍藻細胞中高效表達外源目的基因的策略 ?構建在藍藻細胞中穩(wěn)定性好的表達載體系統(tǒng)。 藍藻在各生長時期均處于感受狀態(tài) ，均可用于轉化，但通常采用對數(shù)生長中期到后期的細胞進行轉化。 主要有 ?變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達的受體細胞所具有的優(yōu)點： ?遺傳背景清楚，不含內源性質粒； ?對外源 DNA無明顯的修飾作用； ?能高效表達鏈霉菌基因以外的其它基因； ?具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng)，并且其內源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。 ?鏈霉菌作為外源基因表達的受體細胞所具有的特點： ?為非致病性細菌，不產生內毒素； ?可進行外源蛋白的分泌表達； ?可進行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級代謝途徑和初、次級代謝調控體系，表達外源蛋白的時間較長； ?鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎。 短小芽孢桿菌型復制子的質粒表達載體在宿主細胞中的 拷貝數(shù)較低，但能穩(wěn)定 存在于宿主細胞中，甚至在沒有抗生素選擇壓力下也不易造成質粒的丟失。 ?提高稀有密碼子 tRNA的表達作用。信號肽 N端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部為疏水氨基酸，它們對蛋白質分泌到細胞膜外起決定性作用。 外源基因 多分子線性重組 的方式通常有三種： ④ 整合型外源蛋白 為防止外源基因隨質粒丟失，將要表達的外源基因整合到染色體的 非必需編碼區(qū) 上，使之成為染色體結構的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達的外源蛋白即為 整合型外源蛋白 。 ③ 寡聚型外源蛋白 為提高外源蛋白表達量，在構建外源蛋白表達載體時，將多個外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質粒載體上，以這種方式表達的外源蛋白稱為 寡聚型外源蛋白 。 包涵體存在部位： 細胞質、細胞周質 包涵體熒光圖 包涵體的組成 蛋
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