《外源基因的表達(dá)》ppt課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 RNA聚合酶 轉(zhuǎn)錄 mRNA 翻譯 蛋白質(zhì) 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下容易發(fā)生 轉(zhuǎn)錄過(guò)頭 的現(xiàn)象，形成長(zhǎng)短不一的 mRNA混合物，而 過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不僅會(huì)影響到 mRNA的翻譯效率 ,同時(shí) 也會(huì)使外源基因的轉(zhuǎn)錄速度大大降低 ，從而影響目的蛋白的翻譯效率。 通過(guò)抑制物基因產(chǎn)物可 使目的基因在宿主培養(yǎng)到最佳狀態(tài)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄 ，從而保證轉(zhuǎn)錄的有效進(jìn)行，特別是表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主有害時(shí)， 控制轉(zhuǎn)錄的時(shí)機(jī) 尤其重要。 （ 3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng) 在原核生物中影響翻譯起始的因素有： 起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ SD序列）、起始密碼子與 SD序列之間的距離和堿基組成、 mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、 mRNA上游的 5′端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的 5′端序列等。 核糖體與 mRNA的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率越高，而核糖體與 mRNA 的結(jié)合程度主要取決于 SD序列與核糖體 16S rRNA堿基的互補(bǔ)性，因此，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，要盡可能使 SD序列 與 16S rRNA序列互補(bǔ)配對(duì)。 ③ 翻譯終止密碼子 翻譯終止密碼子與核糖體相遇時(shí)，能使核糖體從 mRNA模板上脫落下來(lái)，終止蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。 不同生物基因組甚至是同種生物不同蛋白質(zhì)的基因，所用的密碼子都具有一定的 選擇性 。 宿主菌 重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因： ?大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng) ?大腸桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定因子 ?大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度的微環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。 T7表達(dá)系統(tǒng) ：是利用大腸桿菌 T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力。 受體細(xì)胞本身的表達(dá)產(chǎn)物： 如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達(dá)載體編碼的蛋白等。 因?yàn)榘w的水難溶性和密度遠(yuǎn)大于其他蛋白，通過(guò)高速離心即可將包涵體蛋白與其他蛋白區(qū)分開來(lái)； 對(duì)蛋白酶表現(xiàn)出好的抗性。 多表達(dá)單元的重組： 每個(gè)表達(dá)單元都含獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、 SD序列、起始密碼和終止密碼，形成 獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串連翻譯 的表達(dá)單元。該方式適合表達(dá) 中等大小分子量 的外源蛋白。 實(shí)現(xiàn)外源基因與宿主染色體整合是根據(jù) DNA同源交換的原理 ，因此在待整合的外源基因兩側(cè)必須分別組合一段與染色體 DNA完全同源的序列。 ?外源基因整合到染色體上后雖只含有單拷貝，但在合適的條件下仍能高效表達(dá)外源蛋白。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分泌到位于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜與外膜之間的外周質(zhì)時(shí)，信號(hào)肽被 信號(hào)肽酶 所切割。 ① 分泌型可能使蛋白質(zhì)按適當(dāng)?shù)姆绞秸郫B，有利于形成正確的空間構(gòu)相，獲得有較好生物學(xué)活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。 ?提高外源基因 mRNA的穩(wěn)定性。 目前常用作基因表達(dá)系統(tǒng)的有 枯草桿菌 和 短小芽孢桿菌 等。 ② 啟動(dòng)子 芽孢桿菌含多種 轉(zhuǎn)錄起始識(shí)別因子 （ σ）。 噬菌體： 以芽孢桿菌溫和型噬菌體構(gòu)建的表達(dá)載體能將外源基因 定位整合到染色體 上，并且在合適條件下（溫度）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。 鏈霉菌基因表達(dá)載體 ?啟動(dòng)子 結(jié)構(gòu)多樣，至少存在三類鏈霉菌基因的啟動(dòng)子： ?與大腸桿菌基因 10區(qū)和 35區(qū)類似的啟動(dòng)子 ?僅與大腸桿菌基因 10區(qū)類似的啟動(dòng)子 ?與大腸桿菌基因 10區(qū)和 35區(qū)序列均不相同的啟動(dòng)子 ?核糖體結(jié)合位點(diǎn) 類似于其它原核生物的 SD序列： 5′(A/G)GGAGG3′。 ?在所有氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子中某些密碼子使用頻率低于 2％。 四、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng) 藍(lán)藻 —— 又稱 藍(lán)綠藻 或 藍(lán)細(xì)菌 ，它含有葉綠素 a(缺乏葉綠素 b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng) Ⅰ (PS Ⅰ ) 和光合系統(tǒng) Ⅱ (PS Ⅱ )、能進(jìn)行光合作用，但它又 具有細(xì)菌的特征，無(wú)細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。 ?營(yíng)光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、 CO無(wú)機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長(zhǎng)需要。轉(zhuǎn)化過(guò)程中遮光或添加光合作用抑制劑可提高轉(zhuǎn)化效率。
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