【正文】 中震蕩平衡。所得的肽片段質(zhì)量用 MALDITOPMS或 ESIMS進(jìn)行測(cè)定 。 ? 質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)及多肽分析中的應(yīng)用： ? 蛋白質(zhì)的鑒定 ? 磷酸化位點(diǎn)的分析 （ 3）酵母雙雜交技術(shù) ? 酵母雙雜交體系的基本原理： 由于真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子由兩部分獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，即 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ DNA binding domain， BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（ activation domain， AD）。雖然目前已經(jīng)在表達(dá)質(zhì)粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行翻譯后加工修飾的蛋白質(zhì)，尤其是胞外蛋白，不能進(jìn)入核內(nèi)。 ? 生物芯片的特點(diǎn) ：高度平行性；多樣性；微型化；自動(dòng)化。 3. 靈敏度較高 。 ? 按蛋白質(zhì)性質(zhì)分類： ? 無活性芯片 ? 將已經(jīng)合成好的蛋白質(zhì)以高密度陣列點(diǎn)樣在芯片上進(jìn)行雜交反應(yīng) 。 ? 通過信號(hào)強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的。 ? 蛋白檢測(cè)芯片 ?將具有高度親和特異性的探針分子作為配基固定在芯片上 ， 用以識(shí)別復(fù)雜生物樣品中的蛋白質(zhì)或多肽 ， 通過檢測(cè)分析從而判斷樣品中靶分子的性質(zhì)及數(shù)量等 。 2. 具有抗原抗體結(jié)合的高特異性和親和力 。 第八章 生物芯片與蛋白質(zhì)芯片 ? 1. 生物芯片及其特點(diǎn)、分類 ? 2. 蛋白質(zhì)芯片及其特點(diǎn)、分類 ? 3. 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的簡要操作步驟（以樣品直接熒光標(biāo)記為例） 1．生物芯片 ? 生物芯片 （ biochip） ： 基于生物大分子 （ 核酸和蛋白質(zhì)等 ） 相互作用的大規(guī)模并行分析方法 ， 并結(jié)合微電子學(xué) 、 微機(jī)械 、 化學(xué) 、 物理和計(jì)算機(jī)等多領(lǐng)域的技術(shù)及生命科學(xué)研究中所涉及的樣品反應(yīng) 、 檢測(cè)和分析等連續(xù)化 、 集成化和微型化的過程 。 ? 由于有些蛋白質(zhì)本身有激活轉(zhuǎn)錄活性，不經(jīng)過雙雜交相互作用就能激活報(bào)告基因的表達(dá)，因此酵母雙雜交系統(tǒng)不適用。 所有的肽質(zhì)量最后與數(shù)據(jù)庫中理論肽質(zhì)量相配比 （ 理論肽是由實(shí)驗(yàn)所用的酶來 “ 斷裂 ” 蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的 ） 。 2. 將感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切割下來 。 ? 第一向 IEF電泳系統(tǒng)中含有高濃度的 尿素 和適量的 非離子型去垢劑 NP40，而且蛋白質(zhì)樣品處理液中還需含有 二硫蘇糖醇（ dithiothreitol， DTT） 。不僅在同一機(jī)體的不同發(fā)育階段有明顯的差異，在機(jī)體的不同組織和不同細(xì)胞中，以及生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)也各不相同。 ? 蛋白質(zhì)組學(xué)（ proteomics）： 從整體上研究細(xì)胞或組織內(nèi)，特定的時(shí)間和空間內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其相互作用規(guī)律的學(xué)科。 ? 11. 蛋白質(zhì)組學(xué)在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用。 ? 2. 蛋白質(zhì)組和基因組的主要區(qū)別。 ? 序列的相似性（ similarity） ：在序列對(duì)比中描述兩條序列之間相同堿基或氨基酸殘基所占比例（可進(jìn)行量化） 。 4. 其他 。 ? 5. 簡述序列對(duì)比的理論基礎(chǔ)。 4．各種蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)方法 ? 凱氏定氮法。 ? 用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜或 NC膜上。室溫避光反應(yīng) 15 min。C反應(yīng)過夜。它是以卵白素作為橋，把生物素化的抗體（二抗）與生物素結(jié)合酶（如生物素標(biāo)記的 HRP）連接起來，形成 avidin－biotin－ enzyme plex，即 ABC。 ? 2）免疫動(dòng)物制備多克隆抗體或細(xì)胞融合制備單克隆抗體。 第五章 蛋白質(zhì)的定性定量檢測(cè) ? 基本概念 ? 免疫組織化學(xué) ? ABC法 ? 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ ELISA） ? Western blotting/免疫印跡 ? 回答問題： ? 1．免疫組織化學(xué)基本概念和操作過程、顯色反應(yīng) —— ABC法的基本原理及其操作過程。 ? β ME使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài)，以便蛋白質(zhì)與 SDS充分結(jié)合，從而完成第二向的樣品處理。 ? IEF/SDSPAGE的第一相常用 柱狀電泳 ，第二相常用 板狀電泳 。 ? 蛋白質(zhì)被 PAGE電泳所分離，主要基于 電荷效應(yīng) 和 分子篩效應(yīng) 。常用的梯度介質(zhì)有甘油、蔗糖、溴化鉀、氯化銫。 ? 雙縮脲反應(yīng)： 蛋白質(zhì)和多肽分子在堿性溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，稱為雙縮脲反應(yīng)。 ? 凝固作用： 結(jié)絮后的蛋白進(jìn)行加熱后會(huì)變?yōu)楸容^堅(jiān)固的凝塊，稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。 （ 4）蛋白質(zhì)的變性 ? 蛋白質(zhì)的變性： 在某些物理或化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象破壞（不包括肽鏈的斷裂等一級(jí)結(jié)構(gòu)變化），導(dǎo)致蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的改變。 ? 酸性蛋白（ pI7）和堿性蛋白（ pI7） ? 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的 pH大于等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。 ? 利用蛋白質(zhì)工程的技術(shù)手段，得到非天然存在的蛋白質(zhì)。 ? 5. 維系蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力有哪些？什么情況下蛋白質(zhì)存在四級(jí)結(jié)構(gòu)？ ? 6． 蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有哪些？ ? 7． 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本概念？蛋白質(zhì)工程的基本概念？蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別與聯(lián)系？ 第三章 主要內(nèi)容 ? 1．蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)層次 ? 2． 蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能 ? 3． 結(jié)構(gòu)生物學(xué) 1．蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)層次 ? 蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位 —— 氨基酸和肽鍵 ? 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) ? 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)： 在多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。 ? 去除 N甲?；?N蛋氨酸。 ? RF3：激活核糖體上的轉(zhuǎn)肽酶。 ? IF3：翻譯起始時(shí)結(jié)合于核糖體 30S亞基靠近 50S亞基的邊界，使大小亞基拆離。 ? 此時(shí)核糖體的Ｐ位被 fMettRNA和ＡＵＧ占據(jù)； 而 A位則空著 ，有待于對(duì)應(yīng) mRNA中第二個(gè)密碼的相應(yīng)氨基酰tRNA進(jìn)入，從而進(jìn)入延伸階段。 ? GTP酶位 ：可水解 GTP，為催化肽基 tRNA由 A位轉(zhuǎn)到 P位提供能量的酶活性部位。一種 aa少的只有 1個(gè)密碼（色氨酸和蛋氨酸），多的可有 6個(gè)，但以 2個(gè)和 4個(gè)居多。 ? 61個(gè)密碼分別代表各種氨基酸（ amino acid， aa）。 ? 肽基轉(zhuǎn)移酶 /轉(zhuǎn)肽酶位 ：肽鏈合成過程中催化形成肽鍵的酶活性部位。 2．原核生物中蛋白質(zhì)合成過程 ? （ 1）起始過程 ? （ 2）肽鏈延伸 ? （ 3）肽鏈合成的終止與釋放 ? （ 4）原核生物中蛋白質(zhì)合成過程所涉及的蛋白因子 （ 1）起始過程 ① 大小亞基分開（在 IF3作用下）； ② mRNA與小亞基結(jié)合 ③形成 30S起始復(fù)合物： 在 IF2作用下， fMettRNAt與 mRNA分子中的 AUG相結(jié)合（在 P位上），即 密碼子與反密碼子配對(duì)， 形成 30S起始復(fù)合物） ④大小亞基結(jié)合，形成有生物學(xué)功能的 70S起始復(fù)合物。 ? IF2： IF2先與 GTP結(jié)合，再結(jié)合 fmettRNA，形成 fmettRNAIF2GTP復(fù)合物，同時(shí)推動(dòng) mRNA在 30S亞基上移動(dòng)，使 fmettRNA到達(dá) P位。 ? RF2：辨認(rèn) UAA和 UGA，進(jìn)入 A位。糖基化、羧基化、磷酸化、乙?；?、甲基化、二硫鍵的形成（多肽鏈內(nèi)或鏈間）和脂基化等。 ? 3. 二級(jí)結(jié)構(gòu)的分類及其形成的內(nèi)在原因？ α螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ?β折疊 /β片層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ?β轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ? ? 4. 蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)及其組合方式 ；超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的區(qū)別與聯(lián)系。 ? 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究方法 ? 借助現(xiàn)代分析手段（ X線晶體學(xué)、核磁共振及電子晶體學(xué)等）直接得到蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的信息； ? 借助數(shù)學(xué)模型、計(jì)算機(jī)軟件等工具，根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)來預(yù)測(cè)其空間結(jié)構(gòu)。 第四章 主要內(nèi)容 ? 1. 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ? 2. 蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 ? 3. 電泳技術(shù) 1．蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ? （ 1）蛋白質(zhì)的兩性電離特性 ? （ 2）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) ? （ 3）蛋白質(zhì)的沉淀特性 ? （ 4）蛋白質(zhì)的變性 ? （ 5）蛋白質(zhì)的紫外吸收特性 ? （ 6）蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng) （ 1）蛋白質(zhì)的兩性電離特性 ? 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的 pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 ? 蛋白質(zhì)變性的發(fā)展 ? 結(jié)絮作用： 通過強(qiáng)酸 /強(qiáng)堿變性后的蛋白，當(dāng)溶液的 pH調(diào)到其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)形成絮狀的不溶物，稱為蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用。由于此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨量成正比，因此可作為氨基酸定量分析方法。 ? 離心時(shí)離心管中的介質(zhì)是不均一的，從近中心到遠(yuǎn)中心密度不斷增加，形成梯度。 （ 3）膜分離法 ? 定義 ? 分類 ? 根據(jù)推動(dòng)力不同，可分為： ? 透析法 （ Dialysis， DS） （以膜兩側(cè)的濃度差為推動(dòng)力） ? 膜過濾法 （以膜兩側(cè)的壓力差為推動(dòng)力） ? 根據(jù)膜孔徑大小不同，膜過濾法可分為： ? 微過濾 （ Microfiltration