生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)(存儲(chǔ)版)
【正文】 白質(zhì)粗制品。 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 （ 3）根據(jù)電荷不同的純化方法 （ 4）利用選擇性吸附的純化方法 （ 5）利用對(duì)配體的特異親和力的純化方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ①透析法 ②超濾法 ③離心法 ④凝膠過濾法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 血液透析 小分子溶出 小分子被帶出 透析機(jī) 透析液 血液 加壓 ①透析 透析法是利用蛋白質(zhì)的分子比較大，不能透過半透膜的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分離的方法。 分離過程是基于蛋白質(zhì)在自由流動(dòng)溶劑和存在于多孔凝膠中的固定溶劑間的分配。 鹽析現(xiàn)象。 ①電泳 SDSPAGE電泳示意圖 ①電泳 等電聚焦在等電聚焦時(shí)，蛋白質(zhì)分子是在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性 pH梯度中進(jìn)行電泳。 配體： 指能與某些蛋白質(zhì)進(jìn)行特異結(jié)合的化合物 ， 如配體的作用物及抑制劑、 激素和受體 、 抗原和抗體 、 酶及底物等 。 4． Folin酚試劑法（ Lowry法） ?又叫 Lowry法 ?其原理是堿性銅試劑與蛋白質(zhì)發(fā)生 雙縮脲反應(yīng) ，然后蛋白質(zhì)中的酚基 （ 如酪氨酸 ） 在堿性條件下很容易將混合試劑 （ 含有磷鉬酸和磷鎢酸 ） 還原或藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán) ， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比 ， 在 650~660nm下測(cè)定光吸收值 ， 即可測(cè)定蛋白質(zhì)含量 。 ?在堿性溶液中 ， 蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子 ， 一價(jià)銅離子與測(cè)定試劑中的 BCA形成一個(gè)在 562 nm處具有最大光吸收的紫色復(fù)合物 ， 該復(fù)合物的光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度呈正比 。 ?若為兩種分子量不同的蛋白質(zhì)混合時(shí) ，則形成二條分界線 。 。 ?在紙上電泳為一條區(qū)帶的樣本 ， 在聚丙烯酰胺凝膠泳時(shí) ， 可能分成數(shù)條區(qū)帶；如結(jié)合等電聚集電泳則更可提高分辯力 ， 很容易檢出微量雜蛋白質(zhì)的混存 。 ?常用此反應(yīng)來定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量 。 ?雙縮脲法的測(cè)定范圍為 1~10 mg蛋白質(zhì) 。 吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和蛋白質(zhì)的性質(zhì)三個(gè)因素。 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）可以完全依據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，來對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用這一特性，可以通過改變?nèi)芤旱?pH，使要分離的蛋白質(zhì)沉降出來，這些蛋白質(zhì)仍然能夠保持天然的生物學(xué)活性，該方法可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的粗分離。 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ③離心法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 凝膠過濾層析也稱為分子篩層析，可以對(duì)含有不同大小分子的混合物進(jìn)行分離。 （ 3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 常用的方法有：層析法（凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等）；電泳法和超離心法等。 常用的破碎方法有：機(jī)械破碎法、滲透破碎法、反復(fù)凍融法（對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法）、超聲波法和酶法等。 而帶有負(fù)電荷的稱之為陽離子樹脂。 Rf也就是原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)（即原色點(diǎn)）中心的距離 (DA)與原點(diǎn)到溶劑前沿的距離（ Ds）的比值。 1．層析法的基本原理 利用層析法分離混合物，例如氨基酸混合物，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異 ，哪怕是很小的差異，一般差異越大，越容易分開。 五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)是指利用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或利用肽鍵、以及酚基等特殊氨基酸殘基的特性，使其與一些試劑發(fā)生反應(yīng)而生成有色物質(zhì)。 物理因素有加熱（ 70～ 100℃ ）、劇烈振蕩或攪拌、紫外線及 X射線照射、超聲波等。 4．生物堿試劑以及某些酸 類沉淀蛋白質(zhì) 某些生物堿試劑（如苦味酸、鎢酸、鞣酸、碘化鉀等）及某些酸（三氯乙酸、水楊磺酸、硝酸等）與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀。 常用： 以硫酸銨（中性鹽）最常應(yīng)用。 蛋白質(zhì)溶液也具有布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾效應(yīng)以及不能透過半透膜等性質(zhì)。 蛋白質(zhì)在水溶液中的顆粒約為 1~100 nm，所以蛋白質(zhì)溶液屬于膠體系統(tǒng)，是一種親水膠體，蛋白質(zhì)分子顆粒是 分散相 ，水是分散介質(zhì)。 1．鹽析和鹽溶法
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