【正文】 igase 65176。 ligation 之前 ,微熱 (37 176。 in ml eppendorf tubes. Wash the beads 4X with PBST ( % bME optional) and 2X with thrombin cleavage buffer. Stop here if protein bound to beads is needed for binding study. Resuspend the beads in 150 ul thrombin cleavage buffer and add ug thrombin . Incubate at room temperature with mixing for 1 hour. Recover the supernatant containing the fusion protein by centrifugation. Stop the reaction with ul PMSF. Incubate at room temperature 1539。 pH39。Blin 法修改核質(zhì) . 酸 . 3:2303,1976) 預(yù)先準(zhǔn)備 : 飽和苯酚 ,55℃水浴 ,和 55℃ 20 毫米的 TrisHCl,pH 值 。g/ml .蛋白酶 K). ml H2O 40 181。一些實(shí)驗(yàn)也建議補(bǔ)充同等體積的 40%甘油和半體積的 M NaCl Send ments and updates to Dr. Bart Frank, Arthritis and Immunology Program, OMRF 蛋白電泳凝膠考馬斯亮藍(lán)染色 1. 經(jīng)蛋白電泳凝膠 ,凝膠轉(zhuǎn)移至染色圓托盤(pán) . 放入 ~200毫升蛋白質(zhì)凝膠染色試劑 . 2. 微波 ~45秒 ,直到溶液剛開(kāi)始煮沸 . 在常溫輕輕震蕩孵育 1015分鐘 . 加熱使凝膠染色速度 . 另外 ,泡膠著色為 1小時(shí)室溫 . 3. 把染液收回瓶以后再用 . 用水漂洗凝膠 . 放入 ~200 毫升蛋白質(zhì)凝膠脫色試劑 . 微波 ~45 秒 ,直到溶液剛開(kāi)始煮沸 . 在常溫 15分鐘。 C 透析瞬間煮沸的透析管溶液：冰凍的 20mMTrisHCl,10mM 氯化鈉、 EDTA. 透析液 2升透析 3X. 260nm 和 280nm 處測(cè)定 DNA. 一個(gè)典型 的產(chǎn)量從 1克肝或 108細(xì)胞是 510 毫克，在 260nm和 280nm 處 分離外周血白細(xì)胞 : 改裝 wyman 白色芯片 77:67546758(1980) 1050ml 外周血抗凝、 EDTA 是首選 . 用離心機(jī) 300xg(1200 年貝克曼的 RPM和 TJ6 離心機(jī) )室溫下離心顆粒細(xì)胞 10分鐘 . 清除及凍結(jié)血漿 (如有需要 ). 黃色細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中 . 在 PBS中混懸其余黃色細(xì)胞層和紅細(xì)胞 ,用 %的 EDTA(1:186 稀釋， EDTA )和 respin. 加上 初步收集黃色 細(xì)胞層 ,旋轉(zhuǎn)一次或兩次降低紅細(xì)胞并轉(zhuǎn)移白細(xì)胞到一個(gè)新的管中 . 最后含有大約等量白血細(xì)胞數(shù)量和紅血球是較好的 . 3 個(gè)小時(shí) ,同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn) 1020ml 在預(yù)先加熱 55℃溶解溶液 (1mM EDTA,10 mM TrisHCl,pH ,10 mM 氯化鈉 ,1%SDS 和 100微克 /毫升蛋白酶鉀 ). 34倍苯酚 /氯仿溶液 ,每次丟棄下層 . 乙醚或氯仿提取 . 不應(yīng)看到的 提取后溶液有血紅蛋白 . .在 12ml混懸液中 ,處理 RNAse 20ul/ml, 1 小時(shí) ,37℃ . 3 倍酚提取 . 乙醇沉淀、 混懸液 . 一個(gè)典型的 DNA 產(chǎn)量為 200400181。 pH 2% SDS 10% Glycerol 1% bMercaptoethanol mM EDTA % Bromophenol Blue To make a 4X Stock (10 ml) ml 1M TrisHCl。 C處理 30 min ,然后加入凝膠 這不是樣品加載之前運(yùn)行的 .蛋白質(zhì)凝膠電泳要比核酸凝膠慢 ,因此可能需要更長(zhǎng)的電泳時(shí)間 .電泳的條件是 :20CM 凝膠，電泳 3~4小時(shí) ,當(dāng)然電泳所需的時(shí)間取決于樣品性質(zhì) .電泳的功率約為 23 watts,電泳約 30 minutes ,之后功率 增加到 810 做法是 ,使用 markers 對(duì)泳動(dòng)樣品 進(jìn)行標(biāo)記 ,這樣可以達(dá)到兩個(gè)目的 : (1)監(jiān)控電泳過(guò)程 ,指示任何運(yùn)行凝膠 .(2)提供分子量標(biāo)記 ,以便于讓你標(biāo)記所需要的電泳時(shí)間 . 固定干燥 蛋白質(zhì)凝膠電泳類似于核酸凝膠電泳，但蛋白質(zhì)凝膠要注意濃縮層的輻射作用，并注意將輻射層銷毀處理．如果凝膠層中含有被 32P標(biāo)記的樣品ＤＮＡ，你也可以將其干燥處理后直接用于核酸凝膠電泳．如果凝膠中含有 35S 蛋氨酸樣品必須固定凝膠，洗凈，擴(kuò)增（使用 Amersham 進(jìn)行擴(kuò)增可以大大縮短暴光時(shí)間）放射自顯影，固定凝膠，洗脫 20 min： 50% methanol， 10% acetic acid, 40% water，將凝膠浸泡水中，洗凈，擴(kuò)增裝置中洗滌 20 min，純水中漂洗．如果沒(méi)有過(guò)多的游離 methione 擴(kuò)散到溶液中，擴(kuò)增裝置可以重復(fù)使用３～４次甚至更多次．這些游離的 methione 會(huì)使電泳的結(jié)果偏大．將凝膠轉(zhuǎn)移到 saran wrap，經(jīng) Whatman 濾紙?zhí)幚?，真空干燥，這樣凝膠中被 32P 標(biāo)記的樣品將暴露出來(lái)．除去含有 35S 樣品的凝膠中的 saran wrap．注意在凝膠表面覆蓋一薄片，這樣一來(lái)，凝膠層就不會(huì)粘在顯影膠片上了．我運(yùn)用他并使用 kimwipe 是可行的．非放射性 凝膠染色會(huì)造成 coomassie blue，銀的污染．這一方法是全新的，但通常我們不運(yùn)行這一類型的凝膠，因此在這里我就不作詳細(xì)介紹了，如果有誰(shuí)認(rèn)為自己不需要染色非放射性凝膠．，我會(huì)非常樂(lè)意提供一些參考意見(jiàn)． 試劑 RECIPES: 1. Stacking Gel Buffer 125 mM TrisHCl。 4C 離心至細(xì)胞碎片沉于離心管底部 ,取上清 , 70176。 如果你所使用的 ligation 有問(wèn)題 ,可以向 NEB FAQ39。反應(yīng)條件是：質(zhì)粒載體 50 ng，按插入 DNA片段與質(zhì)粒 2:1的摩爾比例，加入標(biāo)準(zhǔn) T4 ligase， 置 16 176。 由于 buffer 含有 ATP， 因此反復(fù)冰凍、解凍溶解將降低 ATP活性從而影響連接酶的催化作用。 如果用 于插入 DNA的質(zhì)粒鏈的比率過(guò)高，超過(guò) 39。末 端核甘和 5’磷酸之間磷酸二酯鍵的形成。反應(yīng)過(guò)程中鹽的污染有二 個(gè)主要來(lái)源 : 反應(yīng)管邊沿沾附的及使用 PE 洗脫過(guò)程中殘余的 PB。這一步操作 可以參考 sequencing center。往每一支 QIAprep spin column 中加入 50 μ l Buffer EB (10 mM , pH )或滅菌蒸餾水洗脫 DNA，靜置 1min， 離心 1min。 雖然說(shuō)這個(gè)步驟僅供選擇，但是實(shí)際上它并不影響到產(chǎn)品的擴(kuò)增，當(dāng)使用 XL－ 1和 DH alpha 作宿主菌時(shí)， 你可以省去這些洗滌步驟 ....你可以認(rèn)為你正在操作 endA菌株，而實(shí)際他們是 endA＋菌株。 避免局限性沉淀 , 小心而充分混勻，立即加入 Buffer N3, 立即產(chǎn)生渾濁。 實(shí)驗(yàn)步驟 250 μ l buffer P1 中 (4 176。 Buffer P1 （你也可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)）： 50 mM TrisHCl pH 10 mM EDTA 10 μ g/ml RNaseA ordered 和 RNaseA 也可以按 Qiagen 設(shè)定。 E. coli .加入 2 μ l Shot174。 使用下列試劑建立以下 TOPO174。 II. TOPO174。 C，在這個(gè)溫度下 Taq DNA Polymerase 具有較高的酶促活性，有利于 DNA 的復(fù)制。加入這些試劑以后，引物 — 模板DNA的溶解溫度會(huì)發(fā)生比較大的變化，因此采用的退火溫度要根據(jù)實(shí)驗(yàn)本身具體確定。 若 GC含量大于 50%，則變性時(shí)間要延長(zhǎng)到 10MIN。 然而，如果反應(yīng)混合物中混有抑制劑 (舉例來(lái)說(shuō) , 如果反應(yīng)使用的模板 DNA純化程度不 夠高 ），比較高含量的 Taq DNA 聚合酶 (23 u) 可能獲得更高的擴(kuò)增產(chǎn)物率。 雖然用于脫氧核糖 核酸 洗凈規(guī)程的甚而痕量代理 (酚、乙二胺四乙酸、蛋白酶 K等等 )強(qiáng)烈禁止 Taq 脫氧核糖核酸聚合酶、脫 氧核糖核酸的對(duì)氨基苯甲酸二降雨雪和脫氧核糖核酸藥丸的反復(fù)治療與 70%對(duì)氨基苯甲酸二通常是有效的 在去除污染物蹤影從脫氧核糖核酸樣品。有關(guān) PCR 實(shí)驗(yàn)室裝備和儀器維護(hù)的詳細(xì)指令在 PCR 方法和應(yīng)用軟件 3,2,S1S14,1993 中可以查找得到 . 一 .反應(yīng)混合體系的準(zhǔn)備 建立多個(gè)平行反應(yīng)體系 ,在單一反應(yīng)混合管中加入水 ,dNTPs ，引物和 Taq DNA 聚合酶 , 然后 分別 進(jìn)入 各 管中 進(jìn)行 消化，接著添加適量 MgCl2 和模板 DNA 。實(shí)驗(yàn)方案 1. PCR 2. Topo 復(fù)制 3. 變形轉(zhuǎn)化 4. Minipre DNA 5. 酶切 6. DNA 膠化回收和純化 (參照 Qiagen 記錄 ) 7. 連接酶 8. 陽(yáng)性克隆對(duì)照 8. GST 融合蛋白質(zhì)準(zhǔn)備 I. Protocol for PCR with Taq DNA Polymerase II. TOPO174。 必須不定時(shí)對(duì)模板 DNA 反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控 ,以確保其沒(méi)有受到污染 .DNA這只是一個(gè)比較粗糙實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 幾乎所有定期方法為模板脫氧核糖核酸洗凈是適當(dāng)?shù)摹? 比較高的 Taq DNA 聚合酶濃度易引起非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。 C ，變性 時(shí)間是 35 分鐘。 此外，添加甘 油（ 1015vol.%) 、 DMSO(10%) 或 formamide(5%) 可促進(jìn) DNA 變性。 延伸階段 延伸溫度一般為 7075 176。這樣一來(lái)，若 PCR 產(chǎn)物要轉(zhuǎn)入 T/A 克隆載體，這一步將延長(zhǎng)到 30min。 延伸過(guò)程 7 ~30 minute. Perform the TOPO174。 kit (invitrogen) and invitrogen DH5a and BL21 (DE3) 活性細(xì)胞 E. coli 每轉(zhuǎn)換一次，于冰上溶解一瓶 One Shot174。 C過(guò)夜孵育 . IV. Protocol: QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentr