【正文】 乳液，然后滴加一定量的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。油相：分別量取液體石蠟5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，加入占其體積5%的Span80,攪拌均勻后備用。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積3%( g)的Span80,攪拌均勻后備用。（CSNPs）。 sizesNo.O/W(V/V)Paraffin(ml)Size()PdIA110:15 A220:110 A330:115 A440:120 A550:125 油水比對納米粒子的影響Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。 不同油相比納米粒子的TEM圖Fig. TEM images of nanoparticles39。表25 Span80用量對納米粒子的影響Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。綜上，span80用量為油相體積的3%時，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。表26殼聚糖濃度對納米粒子粒徑的影響Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。因此，通過TEM圖表明，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL時，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。戊二醛結(jié)構(gòu)中存在著兩個活潑的醛基，有很高的反應(yīng)活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應(yīng)，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。由粒徑分布圖看出，殼聚糖納米粒子粒徑與油水相比成反比，與表面活性劑用量成正比，與殼聚糖濃度與成正比，與交聯(lián)劑濃度成正比，與油相體系的粘度成反比。硒代胱氨酸溶液的配制：取15 mg mL HCl (1M)溶液中配配制成濃度為10 mg/ml的硒代胱氨酸溶液。從TEM圖中可觀察到，殼聚糖納米粒子包裹了一定量的SeC,且粒徑隨著投藥量的增加而增加。第四章 體外抗腫瘤活性的研究 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)試劑表41實(shí)驗(yàn)試劑Table41 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產(chǎn)地液體石蠟AR天津市化學(xué)試劑公司Span80CP天津市化學(xué)試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司硒代胱氨酸ARSigma公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司MTT ARCell Signaling TechnologyDMEBARSigma公司DMSOAR天津市百世化工有限公司實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比[38]。 實(shí)驗(yàn)步驟（1）殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子的制備根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，制備殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，CS:SeC = 2:1,制備納米粒子方法同實(shí)驗(yàn)三。 載藥殼聚糖納米粒子的TEMEDX分析A. TEM圖 B. EDX分析 載藥率與包封率通過ICPAES測得 mg/L, 計(jì)算得出包封率 = %；載藥率=% 細(xì)胞存活率通過MTT法分別測試24h殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子和SeC對MCF7乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用。最后考察了殼聚糖納米粒子作為載體負(fù)載SeC與SeC對MCF7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。而我們的研究將促進(jìn)殼聚糖納米粒子的發(fā)展，也將為生物醫(yī)藥研究提供科學(xué)依據(jù)。 Engineering CBiomimetic and Supramolecular Systems, 2009, 29(3): 936941.[37] 魏海霞. 殼聚糖微球的制備及其在藥物載體中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中國新藥雜志, 2008, (13).[38] Chen, T,. Wong. Selenocystine induces caspaseindependent apoptosis in MCF7 human breast carcinoma cells with involvement of p53 phosphorylation and reactive oxygen species generation [J]. The International Journal of Biochemistry amp。amp。后續(xù)工作可以進(jìn)一步研究運(yùn)輸體系在細(xì)胞內(nèi)的代謝過程及提高SeC抗腫瘤活性的機(jī)制。本課題的研究結(jié)果將為開發(fā)更多殼聚糖載體負(fù)載藥物提供科學(xué)依據(jù)。如圖22B所示，Se原子的存在表明SeC已經(jīng)成功的結(jié)合到殼聚糖納米粒子上。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，但死細(xì)胞無此功能。隨著投藥量的增加，產(chǎn)物的粒徑增加，載藥率也隨著增加，但是包封率卻減少。 sizeNo.CS:LSeCSize()PdIF14:1 F22:1 F31:1 SeC投藥量對納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of ratio of CS to SeC on nanoparticles’ size 不同SeC投藥量納米粒子粒徑分布圖Fig. Comparison of ratio of CS to SeC on nanoparticles’ size(F1)CS:LSeC=4:1 (F2) CS:LSeC=2:1 (F3) CS:LSeC=1:1 SeCCSNPs在水溶液條件下的粒徑變化以及第1天的粒徑分布我們制備得到的納米粒子具有強(qiáng)的穩(wěn)定性，能在水溶液條件下穩(wěn)定存在7天，并且分布均勻。根據(jù)此條件，進(jìn)行殼聚糖納米粒子的載藥制備。 shapes of different glutaraldehyde concentration(E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié)通過以上實(shí)驗(yàn)，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個因素的影響——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑用量。 sizes 不同交聯(lián)劑濃度納米粒子粒徑分布圖Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 sizesNo.Glutaraldehyde aq(1%)/mlSize()PdID12 D23 D34 D45 D56 不同交聯(lián)劑體積對納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。這可能是由于乳化劑過少或過多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在TEM成像時的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強(qiáng)度逐漸增加，過量會導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。這可能是由于油相體積較小，乳化時殼聚糖溶液無法形成規(guī)則乳滴，造成交聯(lián)固化后的產(chǎn)物不規(guī)則。隨著油水相體積比增大，水相納米粒子能夠被較厚的油相膜隔離開，降低了在超聲分散過程中納米粒子粘連的幾率，從PdI和粒徑分布圖看出，油水相體積比增大，粒徑分布更加均勻，粒徑減小。（CSNPs）。（CSNPs）。（CSNPs）。本論文研究中以TEM觀察殼聚糖納米材料的結(jié)構(gòu)。激光粒度分析法是根據(jù)激光照射到顆粒后，顆粒能使散射的激光產(chǎn)生衍射或散射的現(xiàn)象來測試粒度分布的。本文通過乳化交聯(lián)法制得殼聚糖納米粒子載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對MCF7進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對MCF7的細(xì)胞毒性，并在較短的時間內(nèi)起作用。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的納米粒子，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成納米粒子系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長效緩釋靶向的目的。(4)降低藥物的毒副作用，提高療效載有藥物的殼聚糖納米粒子循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對機(jī)體正常組織的毒副作用，同時由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。Hejazi等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖納米粒子。 沉淀法反應(yīng)示意圖(6)其他制備方法制備殼聚糖納米粒子的方法還有很多。 逐層自組裝反應(yīng)流程(4)界面聚合法界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水/油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。(2)噴霧干燥法噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。它能保護(hù)包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基2脫氧D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為(14)2乙酰胺基2脫氧D葡聚糖[27]。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他親水性生物可降解聚合物[23]。納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在一下幾個方面：控釋載藥微粒，靶向載藥微粒，磁導(dǎo)航靶向載藥微粒，基因載體[20]。1990年7月，在美國巴爾的摩召開了第一界國際納米科技會議，標(biāo)志著納米科技的正式誕生。Chen等[15]通過實(shí)驗(yàn)比較幾種含硒化合物對八種人類癌癥細(xì)胞的抗癌活性，實(shí)驗(yàn)證明，SeC與亞硒酸鹽對A375，MCF7，HepG2，SW620等癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸鹽等強(qiáng)。無機(jī)硒具有較好的抗癌活性，但無機(jī)硒化合物脂溶性差，不易進(jìn)入細(xì)胞，且具有蓄積毒性和致突變作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用。硒可以保護(hù)心臟、肝臟等免受損傷，對癌癥、心血管疾病、艾滋病等起到治療和控制作用[57]。1817年，硒由瑞典學(xué)者Berzelius發(fā)現(xiàn)，并命名為Selenium。高分子載藥納米粒子是近年來發(fā)展起來的新劑型，藥物經(jīng)其包裹后，不僅可以提高藥物穩(wěn)定性，而且還可以大大提高藥物的生物利用率。最后通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，表明以殼聚糖納米粒子為藥物載體能夠增強(qiáng)SeC對MCF7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，并增強(qiáng)其體外抗腫瘤活性。1973年，Rotruck等人發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過氧化物酶GSHPx的活性成分后[3]，已經(jīng)陸續(xù)有25種含硒蛋白被發(fā)現(xiàn)。近年來，硒與硒化合物的抗腫瘤活性受到普遍關(guān)注，人們一直致力于設(shè)計(jì)和改造含硒化合物，以尋找抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣，毒副作用低，適用于臨床的含硒抗腫瘤藥物[1]。從此有機(jī)硒化合物的研究引起了廣泛關(guān)注，Shahd等人在2005年報(bào)道了有機(jī)硒化合物Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治療子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌[13]。因此，SeC是一種新型高效的抗腫瘤藥物。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)，表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)四大效應(yīng)。一種理想的納米藥物載體應(yīng)具備以下特征[21] ：①具有較高的載藥量②具有較高的包封率 ③制備和純化方法簡便，容易放大到工業(yè)化生產(chǎn) ④載體材料可生物降解，毒性較低或沒有毒性 ⑤具有適當(dāng)?shù)牧脚c粒型 ⑥具有較長的體內(nèi)循環(huán)時間納米藥物載體的種類有以下幾種（）：①納米聚合物藥物載體 ，包括：聚合物納米粒（納米囊和納米球）納米樹突狀聚合物和聚合物膠束②納米脂質(zhì)體藥物載體，③納米病毒藥物載體，④碳納米管[22]。用于納米藥物載體的生物大分子主要包含蛋白質(zhì)和多糖兩大類。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于PH（13 %）溶液中[28]。(1)乳化交聯(lián)法乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖納米粒子的常用方法之一。He等[35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖納米粒子粒徑在312 μm之間。 界面聚合法反應(yīng)流程(5)沉淀法沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備納米粒子。Sinha等[28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖納米粒子。(2)緩控釋給藥殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類或酸酐類藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖納米粒子內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋，控釋特點(diǎn)。同時殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。 mg。散射式納米粒度分析儀基于