11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-免費(fèi)閱讀
【正文】 結(jié)論 綜上所述，本研究采用理性設(shè)計(jì)的方法，對(duì)來(lái)自 A. terreus 的脂肪酶 ATL 的蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域中的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到了對(duì)對(duì)硝基苯酚酯類(lèi)底物催化活性顯著提高的兩種突變酶 ATLLid 和 ATLV218W。 但它的發(fā)展受以下幾個(gè)因素制約 : :以分子定向改造為目標(biāo)的蛋白質(zhì)工程須借助于精確的三維結(jié)構(gòu)信息 ,而目前主要靠 X射線(xiàn)單晶體結(jié)構(gòu)分析 ,受到單晶培養(yǎng)的限制 。 若再度使用小鼠單抗 , 不僅會(huì)中和單抗使之失效 ,還產(chǎn)生有害的過(guò)敏反應(yīng) 。他們還發(fā)現(xiàn)酶與過(guò)渡態(tài)分子的結(jié)合力可直接影響酶促反應(yīng)的速度。 穩(wěn)定性： 轉(zhuǎn)化子在有絲分裂過(guò)程中，多數(shù)經(jīng)過(guò)幾十代的有絲分裂。 宿主細(xì)胞為組氨酸脫氫酶缺陷型 (HIS4一 ) 牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表達(dá) 牛溶菌酶作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁 ， 具有抗蛋白酶的功能 。 5’或 3’端的剪接 融合基因可以用于在體外產(chǎn)生不同基因或基因片段之間的融合，產(chǎn)生融合蛋白。 ?采用放射性同位素標(biāo)記底物進(jìn)行脂酶的篩選取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種方法靈敏而且準(zhǔn)確，但由于放射性其使用會(huì)受到限制無(wú)法推廣使用。 ? 微球細(xì)胞固定法 與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。 DNA改組和外顯子改組 ? DNA改組 (DNA shuffling)又稱(chēng)有性 PCR (sexual PCR)，原理如圖所示。 ? 所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱(chēng)實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過(guò)人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制 (隨機(jī)突變、重組和自然選擇 )，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 ② 結(jié)構(gòu)和生物功能的聯(lián)系是否明確。 合理設(shè)計(jì)的技術(shù)需求 三類(lèi)專(zhuān)家： ①蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的專(zhuān)家； ②蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的專(zhuān)家； ③基因工程的專(zhuān)家。 ?間接法： 從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來(lái)推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其所含的氨基酸序列 , 而氨基酸的序列又由其編碼基因的核苷酸序列所決定。 位點(diǎn)特異性突變 — 基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué) 基因突變 隨機(jī)突變 —— 基于高通量篩選法 基因剪接 基因內(nèi)部的剪接 5‘或 3’端的剪接 ? 定點(diǎn)突變（ 酶分子的理性設(shè)計(jì) ） ? sitedirected mutagenesis ? 酶分子基因序列中特定位點(diǎn)引入突變，這種突變包括特殊堿基的添加、刪除、取代等。 蛋白質(zhì)工程的這一程序不是一次就能實(shí)現(xiàn)的，往往要經(jīng)過(guò)多次的循環(huán)，不斷改進(jìn)設(shè)計(jì)方案才能發(fā)現(xiàn)一個(gè)理想的新改性蛋白。 酶的定向進(jìn)化 1993年 ,美國(guó)科學(xué)家 Frances H Arnold （ 加州理工大學(xué) ， 生物化學(xué)家 ） 首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念 ， 并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶 。 隨機(jī)突變的策略 ?易錯(cuò) PCR技術(shù) (errorprone PCR) ?DNA改組 (DNA shuflling)：由美國(guó) Stemmer 于 1994 年首次提出 一項(xiàng)體外重組技術(shù) ?隨機(jī)引發(fā)重組 (RPR) 1998 年 ,Arnold 提出了一種有效的新方法 ?交錯(cuò)延伸技術(shù) (StEP)：由 Zhao 等提出 , 是一種簡(jiǎn)化的 DNA shuffling 技術(shù) 易錯(cuò) PCR ?易錯(cuò) PCR（ error prone PCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入 堿基錯(cuò)配 ，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。 基因突變庫(kù)的篩選方法 ? 活體篩選法 遺傳互補(bǔ)篩選法 ? 活體 離體篩選法 噬菌體展示法；細(xì)胞表面展示法（細(xì)菌、纖毛蟲(chóng)細(xì)胞、酵母等） ? 離體篩選法 1）核糖體顯示技術(shù) 2） RNA蛋白質(zhì)融合技術(shù) (RNA顯示技術(shù)） 定向進(jìn)化的篩選策略 ? 瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過(guò)宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 ? 通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的顏色和熒光的變化可以有效地監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行。 ? 兩者的不同： ?進(jìn)化動(dòng)力不同： 保守突變 非保守取代； ?進(jìn)化方向不同： 適應(yīng)突變的積累； ?進(jìn)化速度不同： 非常漫長(zhǎng) 只需幾年、甚至幾天； ?進(jìn)化目標(biāo)不同： 適應(yīng)環(huán)境 超越生物學(xué)意義的要 求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。 釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒 釀酒酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)： 嗜甲醇的酵母 (Pichia pastoris) 優(yōu)點(diǎn) ： 能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)。優(yōu)點(diǎn)：載體質(zhì)?？蛇M(jìn)行同源整合，易于篩選； 缺點(diǎn)：大多數(shù)絲狀真菌難獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型。末端形成酪氨酰 tRNA。 抗體工程的設(shè)計(jì)與研制
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