11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-全文預(yù)覽
【正文】 擾素 Cys→ Ser 提高穩(wěn)定性 成功 ─────────────────────────── ─────────────────────────── ─────────────────────────── 白細(xì)胞介素 2 Cys→ Ser 提高產(chǎn)物活性 不成功 (產(chǎn) 物穩(wěn)定性 ↓ ) ─────────────────────────── ─────────────────────────── ─────────────────────────── 二氫葉酸 Asp→ Asn 驗證酶的活性 成功 中心還原酶 ─────────────────────────── ─────────────────────────── ─────────────────────────── 二 . 蛋白質(zhì)工程的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1. 關(guān)于分子導(dǎo)向多肽藥物的設(shè)計與研制 : 人們希望利用特異性結(jié)合的特點 ,將單克隆抗體作為定向載體 ,但是有關(guān)單克隆抗體與藥物、核素、毒素的耦合物試驗結(jié)果并不理想。末端形成酪氨酰 tRNA。但經(jīng)過減數(shù)分裂表現(xiàn)出高度的不穩(wěn)定。優(yōu)點：載體質(zhì)粒可進(jìn)行同源整合，易于篩選； 缺點：大多數(shù)絲狀真菌難獲得營養(yǎng)缺陷型。 可用作為促進(jìn)反芻動物消化的飼料添加劑 。 釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒 釀酒酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點： 嗜甲醇的酵母 (Pichia pastoris) 優(yōu)點 ： 能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長。 ① 避免目的蛋白在表達(dá)時被降解 ② 增加分泌性 ③ 提高溶解性 ? 重組酶的高效表達(dá) ? 一、細(xì)菌表達(dá)體系 ? 二、酵母系統(tǒng)中的表達(dá) ? 三、絲狀真菌中的表達(dá) 體系生產(chǎn)重組酶 常用宿主菌株的基因型 DH5： supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1 JM109: supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1 ?(lacproAB) / F’[traD36, proAB+, lacIq, lacZ ?M15 大腸桿菌表達(dá)載體必備元件： 二、 酵母表達(dá)系統(tǒng) 例 1： Cu／ Zn超氧化物歧化酶 (Cu/ZnSOD)是重要的醫(yī)用酶。 ? 兩者的不同： ?進(jìn)化動力不同： 保守突變 非保守取代； ?進(jìn)化方向不同： 適應(yīng)突變的積累； ?進(jìn)化速度不同： 非常漫長 只需幾年、甚至幾天； ?進(jìn)化目標(biāo)不同： 適應(yīng)環(huán)境 超越生物學(xué)意義的要 求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。 ?比色和熒光檢測為代表的高通量篩選方法得到了廣泛的應(yīng)用，是當(dāng)前酶的高通量篩選的主要研究和發(fā)展方向。 ? 通過監(jiān)測反應(yīng)過程中的顏色和熒光的變化可以有效地監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行。 ? 流式細(xì)胞計數(shù)法 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行測定。 基因突變庫的篩選方法 ? 活體篩選法 遺傳互補篩選法 ? 活體 離體篩選法 噬菌體展示法；細(xì)胞表面展示法（細(xì)菌、纖毛蟲細(xì)胞、酵母等） ? 離體篩選法 1）核糖體顯示技術(shù) 2） RNA蛋白質(zhì)融合技術(shù) (RNA顯示技術(shù)） 定向進(jìn)化的篩選策略 ? 瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 ? 外顯子改組 (exon shuffling）類似于 DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而 DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。 隨機突變的策略 ?易錯 PCR技術(shù) (errorprone PCR) ?DNA改組 (DNA shuflling)：由美國 Stemmer 于 1994 年首次提出 一項體外重組技術(shù) ?隨機引發(fā)重組 (RPR) 1998 年 ,Arnold 提出了一種有效的新方法 ?交錯延伸技術(shù) (StEP)：由 Zhao 等提出 , 是一種簡化的 DNA shuffling 技術(shù) 易錯 PCR ?易錯 PCR（ error prone PCR）是指在擴增目的基因的同時引入 堿基錯配 ，導(dǎo)致目的基因隨機突變。 ? 酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。 酶的定向進(jìn)化 1993年 ,美國科學(xué)家 Frances H
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