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11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程(存儲版)

2024-09-14 02:05上一頁面

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【正文】 : 蛋白質(zhì)工程中進展最快又與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的是 “ 抗體工程 ” 。 由于該抗體已 “ 人源化 ” , 其免疫原性已大為降低。 ? 土曲霉 A. terreus 脂肪酶基因 ATL序列 (GenBank Accession No. )根 據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性優(yōu)化后,由南京金斯 瑞公司合成。 。人們正試圖尋找高效表達載體、分泌性系統(tǒng)以及各種高效批量分離技術(shù)來克服這一限制。 嵌合抗體 : 是應(yīng)用 DNA 重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū) (V區(qū) )基因與人免疫球蛋白 (Ig)的恒定區(qū) (C區(qū) )基因相連接 ,構(gòu)建成嵌合基因 ,導(dǎo)入宿主細(xì)胞進行表達 ,制成嵌合抗體。 α 轉(zhuǎn)化生長因子 (TGFα) 與綠膿桿菌毒素的Ⅱ 與 Ⅲ 區(qū)段的基因 (PE40)拼接形成的雜合蛋白能夠明顯地延長荷瘤裸鼠 (腫瘤細(xì)胞表面有 TGF的受體 )的生存期 ,但該雜合毒素卻不殺死不帶此受體的細(xì)胞。 : 酪氨酰 tRNA合成酶是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究得比較深入的酶之一 。 絲狀真菌 牛溶菌酶基因表達質(zhì)粒 三、絲狀真菌表達體系 得到發(fā)展主要理由是 ? 絲狀真菌的發(fā)酵技術(shù)成熟,有利于重組蛋白生產(chǎn) 的工業(yè)化; ? 絲狀真菌具有很強的分泌能力,有望提高重組蛋 白的生產(chǎn)效率; ? 新表達系統(tǒng)的建立可避開大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白 的專利限制; ? 米曲霉和黑曲霉等絲狀真菌被 FDA和世衛(wèi)組織認(rèn) 定安全 。 需用 真核系統(tǒng)表達! 基因源:人的 Cu/ZnSOD cDNA基因 質(zhì)粒載體 :釀酒 酵母 2 mm質(zhì)粒 啟動子:酵母甘油醛磷酸脫氫酶 (GAPD)啟動子 附加:轉(zhuǎn)錄終止信號、 poly(A)信號。 定向進化與自然進化的異同點 ? 定向進化的實質(zhì)是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。這種篩選可以在檢測平板中進行,也可以在微孔滴定板中進行,借助一些檢測儀器很容易實現(xiàn)高通量篩選。 交錯延伸 交錯延伸 (stagger extension process, StEP) 在 PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步 , 縮短其反應(yīng)時間,從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。 ? (2) 突變體應(yīng)能在適當(dāng)?shù)奈⑸?(如大腸桿菌或酵母菌 ) 體內(nèi)進行功能的表達 。衡量的標(biāo)準(zhǔn)是看它可能導(dǎo)致什么樣的經(jīng)濟效益和社會效益。 當(dāng)前的分子設(shè)計主要以能顯示圖形圖象的計算機為工具,采用基于物理學(xué)原理的各種模擬方法和基于蛋白質(zhì)的改性分子結(jié)構(gòu)知識的模型構(gòu)建方法,或兼用這兩類方法。 但目前主要是通過基因突變手段以制取天然蛋白質(zhì)的各種人工突變產(chǎn)物。第七章 酶的蛋白質(zhì)工程 現(xiàn)代酶工程的要求 ? 能具備長期穩(wěn)定性和活性 ? 能適用于水及非水相環(huán)境 ? 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 ? 能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料 途徑 方法 優(yōu)點 不足 酶分子改造 核酸水平 蛋白質(zhì)工程 從根本上提高酶分子穩(wěn)定性 操作復(fù)雜,周期長 蛋白質(zhì)水平 化學(xué)修飾 適應(yīng)所有酶,操作簡單經(jīng)濟 修飾過程破壞酶分子 劑型 固定化 適應(yīng)所有酶,穩(wěn)定性高,可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn) 載量較低,易失活 交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好,載量高,催化效率高 成本高 微環(huán)境改良 穩(wěn)定劑 簡單、經(jīng)濟 工作量大 反應(yīng)介質(zhì) 適用于特殊反應(yīng)體系和酶類 適合的酶類還不普遍 改進酶性能的方法 蛋白質(zhì)工程概念: 是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的,以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ),以基因重組技術(shù)為主要手段,對天然蛋白質(zhì)進行分子設(shè)計和改造。 三、蛋白質(zhì)工程的主要手段 蛋白質(zhì)工程的長遠目標(biāo)是創(chuàng)造人類所需要的各種性能優(yōu)越的人造蛋白質(zhì)。 分子設(shè)計專家: 在了解了需要改造的蛋白質(zhì)的性能及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之后,主要通過理論的方法,提出蛋白質(zhì)改性的設(shè)計方案,這一方案將提供改性后的蛋白質(zhì)哪些部分的氨基酸順序與天然蛋白質(zhì)不同,這些新的序列可以導(dǎo)致怎樣的空間結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的變化,從而能賦予新蛋白質(zhì)什么樣的特性。 ③ 所選對象的重要性。 酶分子定向進化技術(shù)的關(guān)鍵 ? 定向進化是一個由構(gòu)建突變體庫,突變體表達,表達后篩選三個步驟組成的循環(huán)遞進過程,需要: ? (1) 產(chǎn)生包含大量帶有微量有利突變的突變體的文庫 。 體外隨機引發(fā)重組 體外隨機引發(fā)重組 (random priming in vitro rebination, RPR)以 單鏈 DNA為模板,配合一套隨機序列引物,先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短 DNA片段,由于堿基的錯配和錯誤引發(fā),這些短 DNA片段中也會有少量的點突變,在隨后的PCR反應(yīng)中,它們 互為引物 進行合成,伴隨組合,再組裝成完整的基因長度。 突變體分離 突變酶分子的高通量篩選策略 檢測培養(yǎng)基篩選法 ? 通常是在
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