北大現(xiàn)代分子生物學課件蛋白質工程概論-免費閱讀
【正文】 v其主要缺點是不能連續(xù)合成重組蛋白，因為重組病毒感染昆蟲細胞或昆蟲幼蟲 45天后，細胞就裂解，幼蟲即死亡。另一項更為新穎的戰(zhàn)略是利用蛋白質組合規(guī)律及結構與功能關系方面的研究結果設計新的蛋白質。v 3．設計和研制多肽及蛋白質類藥物v隨著蛋白質工程技術的建立和發(fā)展，醫(yī)藥生物高科技產品也迅速發(fā)展。如利用基因定點誘變技術，將 T4溶菌酶的 第 3位異亮氨酸 變成 半胱氨酸 ，后者與第 97位的半胱氨酸形成二硫鍵 ，從而穩(wěn)定了兩個結構域所形成的活性中心，使酶在高溫下的穩(wěn)定性大大提高。這些都可以通過蛋白質工程將酶分子中某個或某一段氨基酸殘基更換、增加、刪除或修飾來實現(xiàn)。 蛋白質工程的程序v 分離純化 ~，v 測定其部分肽段一段結構，根據(jù)編碼原則合成相應同位素標記的寡苷酸探針 。其主要研究內容如下：通過改變蛋白質的活性部位，提高其生物功效及獨立工作的能力v用定點誘變技術不僅可以提高蛋白質的穩(wěn)定性，還可以提高酶的活性。v 因此，定點改變這些氨基酸序列，即可能改變蛋白質的功能和特性，使之更適合于工業(yè)化生產的要求。v 該技術具有簡單易行重復性高等優(yōu)點。v如野生型枯草桿菌蛋白酶的 218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有關的氨基酸殘基，若將其變成 絲氨酸 (Ser)，用 65℃ 的失活半衰期衡量，從 59分鐘增到 223分鐘，酶的穩(wěn)定性顯著增加。前者通常為結構的穩(wěn)定所必需，后者多系分子識別及活性重要部位。v20世紀 50年代末用 X射線晶體學方法測定了第一個蛋白質 —— 肌紅蛋白的結構 .v現(xiàn)已有 400多種蛋白質的三維結構被搞清。而蛋白質精細結構的改造，只有利用蛋白質工程技術才能得以實現(xiàn)。v 妨礙酶開發(fā)利用的原因主要有：v 生物材料中酶含量甚少，用傳統(tǒng)方法分離純化酶蛋白成本太高；v 酶蛋白分子結構的穩(wěn)定性差，過酸、過堿、高溫、氧化等因素可破壞其結構，使其喪失生物活性，因而在工業(yè)加工條件下，酶的半衰期短，利用率低；v 酶催化活性的最適 pH值及底物專一性的范圍較窄，與工業(yè)應用的要求有較大差距。v研究蛋白質的結構和功能，繼而人工改造蛋白質的結構，并獲得我們所需要的活性蛋白質，正是蛋白質工程的主要任務和目標 。蛋白質工程概論山東大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所劉賢錫 前言v 基因工程誕生 10周年之際著名科學家 Kevin 于 1983年在 SCIENCE()發(fā)表了論文 171。一、蛋白質工程的概念 Protein Engineeringv蛋白質工程是在重組 DNA技術應用于蛋白質結構與功能研究之后發(fā)展起來的一門新興學科。v 因此，要想擴大酶蛋白的開發(fā)利用，需要建立適當?shù)姆椒ǎ愿纳泼傅鞍椎纳锾匦?，使之適合于工業(yè)應用的需求，這就需要利用蛋白質工程對蛋白質進行改造。（二）蛋白質結構與功能關系研究技術的建立推動了蛋白質結構與功能關系的研究，從而為蛋白質改造提供了理論依據(jù)v 蛋白質工程的重要目標之一，是通過改造蛋白質的結構來提高其開發(fā)利用的價值。v通過蛋白質三維結構的研究有助于了解蛋白質是如何發(fā)揮生物學功能的。v 然后通過計算機按預先設想替換一些側鏈基團，再用計算機尋找經過 “微擾 ”后蛋白質分子的能量趨于極小的狀態(tài)，預測由于這種替換可能造成的后果。v再如氧化失活使枯草桿菌蛋白酶在工業(yè)上的應用受到嚴重限制。它適用于 :v 基因結構與功能的研究，v 通過改變基因的密碼子來改造天然蛋白質，v 用于確定蛋白質中每一個氨基酸在結構和功能上的作用，為人工改造蛋白質提供理論依據(jù)。v 如前所述枯草桿菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的 Ser221鄰近的 Met222易被氧化成硫氫化物，若以其他氨基酸取代 Met222，則可提高酶的氧化穩(wěn)定性而又不影響其催化活性。要改變酶的活性，需要一個詳細描述了酶的活性位點的圖譜。v 以此從基因庫中分離編碼該蛋白質的克隆化基因，轉入噬菌體 M13系統(tǒng)，用雙脫氧末端終止法進行DNA序列分析 。v 如前所述枯草桿菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的 Ser221鄰近的 Met222易被氧化成硫氫化物，若以其他氨基酸取代 Met222，則可提高酶的氧化穩(wěn)定性而又不影響其催化活性。如果將該酶的 第 51位蘇氨酸 換成 脯氨酸 ，可使酶的活性 提高 25倍 。當前，人們不僅可以利用基因克隆和表達技術，使可以應用與臨床的微量蛋白質（如胰島素、干擾素、某些酶類等）得以產業(yè)化生產，而且可以應用蛋白質工程 “重新設計 ”的思想，以 DNA重組技術為手段，對多肽和蛋白質類藥物的結構加以改造，以期更好地解決蛋白質類藥物的導向性問題。v現(xiàn)階段蛋白質工程急待解決的一個主要問題是 發(fā)展克隆基因的表達方法 ，即找到理想的宿主表達系統(tǒng)。哺乳動物細胞v哺乳動物細胞是生產哺乳動物蛋白質最好的場所，其表達真核基因比以前幾種表達系統(tǒng)更優(yōu)越，能對蛋白質進行各種類型的加工和修飾，還能表達有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。昆蟲表
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