【正文】 ? 菌種退化的原因 ? 基因突變； ? 變異菌株性狀分離； ? 誘變的單菌落是由 —個以上孢子或細胞形成 ? 菌落由 —個孢子或單個細胞形成，但它是多核細胞 ? 單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈 DNA上僅 —條鏈上某個位點發(fā)生變化 ? 連續(xù)傳代 ? 其它因素 ? 菌種保藏不當 ? 生長條件不滿足（培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件） ?防止菌種退化的措施 ? 控制傳代次數(shù) ? 選擇合適的培養(yǎng)條件 ? 選擇合適的保藏方法 ? 菌種穩(wěn)定性檢查 ? 分離復壯 菌種復壯 使衰退的菌種重新恢復原來的優(yōu)良特性。 （ 3） 凍結 液氮法的 關鍵 是 先把微生物從常溫過渡到低溫 。 尤其是一些 不產(chǎn)孢子的菌絲體 ， 用其它保藏方法不理想 ， 可用 液氮保藏法 。 因此，菌種可以保存很長時間， 一般 5年左右 。它的 制備方法 是： 首先 ， 將沙與土 洗凈烘干過篩 后 ， 按沙與土的比例為 l－ 2∶ l混合均勻 ， 分裝于小試管中 ， 裝料高度約為 1厘米左右 ，121176。 ? 一種好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟，以便生產(chǎn)上能推廣使用。 生化指標 ?種子液的糖、氮、磷的含量和 pH變化。 ? 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。而培養(yǎng) 5天以后冷藏， 20天未發(fā)現(xiàn)自溶。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)： 在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。 ? 原材料質量的波動，起它要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素 Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。 ? 細菌：生長快 ， 種子用量比例少 ， 級數(shù)也較少 ， 二級發(fā)酵 。 ? 培養(yǎng)溫度一般為 28?C。 ? 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用 液體培養(yǎng)法 (通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。 篩選優(yōu)良性狀融合重組子 ? 原生質體融合后，來自兩親代的遺傳物質經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為 融合重組子。 由于以上優(yōu)點 ， 利用原生質體融合來培育工業(yè)新菌株已受到國內外普遍重視 。 原生質體融合的優(yōu)越性 從現(xiàn)有資料看 ， 原生質體融合技術 有以下 優(yōu)點 （ l）去除了細胞壁的障礙 ，親株基因組 直接融合、交換，實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng) 。 由于 多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代 ， 因此 ， 直接親本菌株應帶有適當?shù)?遺傳標記 。應用的范圍較廣， 嵌入劑： 引起移碼突變。 誘變與篩選 可以說是一個問題的兩個方面 ， 必須用辯證的觀點來看待 。 ? 化學誘變因素一般是以 溶液濃度 來計算劑量單位的 。 （ 3）組成型突變株的篩選 ? 分批限量加入誘導物法，解除菌株對誘導物的依賴 ? 交替培養(yǎng)法 （ 4）抗性突變株的篩選 ? 抗生素抗性突變 ? 抗噬菌體菌株的選育 ? 條件抗性突變 ? 敏感突變 誘變育種工作中幾個應注意的問題 A 選擇好出發(fā)菌株 選好出發(fā)菌株對誘變效果有著極其重要的作用。 誘變育種的一般步驟 出發(fā)菌株的選擇 ?自然界直接分離到的野生型菌株 ?經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株 ?已經(jīng)歷多次育種處理的菌株 制備菌懸液 ? 待處理的菌懸液應考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件； ? 盡可能選擇孢子或單倍體細胞作為誘變對象，避免表型延遲 。 誘變育種的基本原理 ? 誘變育種的 理論基礎是 基因突變 ， 所謂 突變 是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異 。 第二節(jié) 菌種選育 ? 菌種選育 是一門 應用科學技術 ，其 理論基礎 是微生物 遺傳學、生物化學 等，而其研究 目的 是微生物產(chǎn)品的 高產(chǎn)優(yōu)質 和發(fā)展 新品種 為生產(chǎn)不斷地 提供優(yōu)良菌種 ，從而促進生產(chǎn)發(fā)展。 復篩：在初篩的基礎上，進一步鑒定有希望菌株的 生產(chǎn)能力強弱的過程。 純種分離的方法有劃線分離法 、 稀釋分離法 。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 ， 宜將樣品逐步分批寄回 ， 以便及時分離 。 ? 分離篩選： 采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術得到純種目的菌 。 第二章 菌種選育 本章主要內容 ?第一節(jié) 菌種的分離篩選 ?第二節(jié) 菌種選育 ?第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng) ?第四節(jié) 菌種的保藏與復壯 第一節(jié) 菌種的分離篩選 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位 、 高等院校 、 工廠或菌種保藏部門索取或購買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 。 ? 發(fā)酵性能測定： 進行生產(chǎn)性能測定 。 采取土壤樣品要考慮的幾個問題 ? 土質肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細菌多，放線菌少；在植物殘體枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。 ? 一些有特定物質產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。 稀釋分離法 ? 稀釋倒 平板法 ? 平板 涂布法 注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板。 ? 復篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法 進行測定。 ? 目前菌種選育常采用 自然選育 和 誘變育種 等方法，帶有一定的 盲目性 ，尚屬于 經(jīng)典育種 的范疇。 ?突變主要包括 染色體畸變 和 基因突變 二大類 。 ? 表型延遲 就是指某一突變在 DNA復制和細胞分裂后，才在細胞表型上顯示出來，造成不純的菌落。有些微生物 比較穩(wěn)定，其遺傳物質耐誘變劑的作用強 。 對不同微生物使用的劑量是不同的 ， 致死率取決于誘變劑量 ， 而 致死率和變異率 之間有一定關系 。 總之 ， 在誘變育種過程中要正確處理 出發(fā)菌株 ， 誘變因素和篩選條件三者的關系 ?？梢栽斐缮x途徑 完全中斷。 常用的遺傳標記有 顏色 、 營養(yǎng)要求和抗藥性 等 。即使是 相同接合型的真菌細胞 也能發(fā)生原生質體的相互融合， 并可對原生質體進行 轉化和轉染 。 原生質體融合技術一般步驟 選擇親株 選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株； 親株帶上遺傳標記； 測定遺傳標記的穩(wěn)定性 。 ? 融合重組子的檢出方法： ? 直接法 將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。 （一）孢子的制備 細菌孢子的制備 ? 細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。 ? 培養(yǎng)時間為 5~14天。 茄子瓶 → 種子罐 → 發(fā)酵罐 ? 霉菌：生長較慢 ， 如青霉菌 ， 三級發(fā)酵 孢子懸浮液 → 一級