【正文】 pH 值對工程菌生長和表達的影響 在相同通氣量和攪 拌速度下， pH 值對不同菌群生長影響不大，而對外源蛋白表達有一定影響 偏堿性的 pH對外源蛋白的表達不利，因此，表達開始要調(diào)節(jié) pH 在 之間，以保證外源蛋白的高水平表達。但這類方法只適用于小分子底物。適用于多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)。 （五）共價偶聯(lián)法：利用酶表面的反應(yīng)基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機或有機載體反應(yīng)，形成共價鍵將酶固定。 單菌固態(tài)純種發(fā)酵 是在純培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立起來的，對于選育良種、保持生理活性和代謝過程中的穩(wěn)定起很大作用。 （ 2）固態(tài)發(fā)酵的形式 固態(tài)發(fā)酵可分為自然富集固態(tài)發(fā)酵、強化微生物混合固態(tài)發(fā)酵、限定微生物混合固態(tài)發(fā)酵和單菌固態(tài)純種發(fā)酵。 （ 1）恒化培養(yǎng)：使培養(yǎng)基中限制性基質(zhì)的濃度保持恒定； （ 2）恒濁培養(yǎng)：使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定。 在此 過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。改變的主要參數(shù)有菌體繁殖代數(shù)、種子的形成、培養(yǎng)基的滅菌、通氣和攪拌，以及熱傳遞等 3 放大的方法 從小規(guī)模的操作條件到大規(guī)模的放大過程，主要以 單位體積輸入功率相等 和 保持 K Lα 值不變 為基礎(chǔ) 微生物技術(shù)應(yīng)用 10 進行。由于 K d 值不同，使各自培養(yǎng)液中溶解氧的濃度也不同、因而對菌體代謝會產(chǎn)生重要的影響。一 .種子擴大培養(yǎng)的任務(wù)和培養(yǎng)類型 ： ： ①液體培養(yǎng)法 ：液體試管、三角瓶搖床震蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)； ②表面法培養(yǎng)： 液體表層，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培 養(yǎng)。 介質(zhì)過濾 ：捕集粒子及各種微生物。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。 致死溫度 ： 殺死微生物的極限溫度。 化學(xué)滅菌劑： 氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。 ④ 所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。 有機氮源 成分復(fù)雜： 除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。 來源 糖類、油脂、有機酸、正烷烴 工業(yè)上常用的糖類： ① 葡萄糖 ： 所有的微生物都能利用葡萄糖，但是會引起葡萄糖效應(yīng)； ② 糖蜜：糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的 副產(chǎn)物。但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA 為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。 重組 DNA分子導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組 DNA 分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。 （五） 基因工程育種 是指利用 DNA 重組技術(shù) 將 外源基因 導(dǎo)入到 微生物細胞 ，使后者獲得前者的某些 優(yōu)良性狀 或表達前者的 基因產(chǎn)物 而獲得 新種 。 擴大重組的親本范圍 原生質(zhì)體由于完全或部分去除了細胞壁，能實現(xiàn)常規(guī)雜交無法做到的 種種 間間 、 屬屬 間間 、 門門 間間 等遠緣雜交。 雜交育種的方式因?qū)嶒灳甑纳撤绞讲煌悾缬行噪s交、準(zhǔn)性重組、原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化等；但是，選擇親株、分離群體后代的培養(yǎng)、擇優(yōu)去劣和雜種遺傳分析的過程基本是相同的。搖瓶與發(fā)酵罐的條件較為接近，所測得的數(shù)據(jù)就更有實際意義。 復(fù)篩的目的： 確認符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。 出發(fā)菌株應(yīng)具備： ① 對誘變劑的敏感性高； ② ②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力。 一般培養(yǎng)在 30 ℃下。 第三節(jié) 菌種改良 一一 、 菌菌 種種 改改 良良 的的 方方 法法 ：： 自自 然然 選選 育育 、 誘誘 變變 育育 種種 、 雜雜 交交 育育 種種 和和 基基 因因 工工 程程 育育 種種 。 干土噴射法： 又稱干法分離?？上葘⑼翗蛹訜岬?80℃或在 50%乙醇溶液中浸泡 1h，殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再進行分離。 三、 增殖（富集）： 富集的目的： 讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。 2 采樣： 有針對性地采集樣品。 微生物技術(shù)的特點 ：需要多學(xué)科的指示，既多學(xué)科性質(zhì)。 3 工業(yè)上重要放線菌屬： 鏈霉菌屬 、 諾卡氏菌屬 、 小單胞菌屬 、 鏈孢囊菌屬 四、 真核微生物 凡是細胞核 具有核膜、能進行有絲分裂、細胞質(zhì)中存在線粒體或同時存在葉綠體等細胞器的微小生物，都稱為真核微生物。 二、 樣品采集 采樣對象 —— 土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，但總體來講 土壤樣品的含菌量最多。 分離放線菌時，可將樣品液在 40℃恒溫預(yù)處理 20 分鐘 ，有利于 孢子的萌發(fā) ，可以較大的增加放線菌數(shù)目，達到富集的目的。 1． 常用的分離方法 ：水懸浮稀釋法、干土噴射法、孢子飛揚法。 高通量篩選與自動化： 高高 通通 量量 篩篩 選選 技技 術(shù)術(shù) （ High throughput screening， HTS）， 是將各種模型固定在微孔板（ 96 孔甚至 384 孔），進行自動稀釋、加樣，并用機器人讀結(jié)果，用計算機記錄、計算、整理分析實驗結(jié)果，使篩選從繁重的勞動中解放出來，實現(xiàn)了篩選的快速、準(zhǔn)確、微量、重現(xiàn)性高和大規(guī)?；? 誘誘 變變 育育 種種 與與 其其 他他 育育 種種 方方 法法 相相 比比 ， 具具 有有 操操 作作 簡簡 便便 、 突突 變變 率率 高高 、 突突 變變 譜譜 廣廣 的的 優(yōu)優(yōu) 點點 ， 它它 不不 僅僅 能能 提提 高高 產(chǎn)產(chǎn) 量量 ， 改改進進 質(zhì)質(zhì) 量量 ， 還還 可可 擴擴 大大 產(chǎn)產(chǎn) 品品 品品 種種 和和 簡簡 化化 工工 藝藝 條條 件件 ， 至至 今今 仍仍 是是 一一 種種 重重 要要 的的 、 廣廣 泛泛 應(yīng)應(yīng) 用用 的的 微微 生生 物物 育育 種種 方方 法法 。 化化 學(xué)學(xué) 誘誘 變變 劑劑 中中 使使 用用 最最 多多 、 最最 有有 效效 的的 是是 烷烷 化化 劑劑 。 （ 2）誘變處理方式 單一因子處理 復(fù)合因子處理：兩種以上因素先后使用、同時使用或單一因子重復(fù)使用 變株篩選 菌種經(jīng)誘變處理后，會產(chǎn)生各種各樣的突變類型，需要選擇一定的篩選方式，將具有所需性狀的突變株篩選出來。 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等。 （（ 四四 ）） 雜雜 交交 育育 種種 不同基 因型 的品系或種屬間，通過 交配 或 體細胞融合 等手段形成 雜種 ，或者是通過 轉(zhuǎn)化 和轉(zhuǎn)導(dǎo) 形成 重組體 ，再從這些雜種或重組體或是它們的后代中 篩選優(yōu)良菌種 。 原生質(zhì)體融合育種技術(shù) 原生質(zhì)體 （ Protoplast）：采用一定方法技術(shù)去掉細胞壁，剩下的細胞部分稱之為原生質(zhì)體。 4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。 目的基因與載體連接 獲得目的 DNA 片段和載體 DNA 片段后，要把兩者連接起來形成重組體。 轉(zhuǎn)染和感染： 利用噬菌體 DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。 空氣 空氣凈化處理 保藏菌種 斜面活化 擴大培養(yǎng) 種子罐 主發(fā)酵 碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì) 產(chǎn)物分離純化 成品 滅菌 微生物技術(shù)應(yīng)用 7 發(fā)發(fā) 酵酵 類類 別別 ：： 根據(jù)對氧的需要區(qū)分：厭氧和有氧發(fā)酵 根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀區(qū)分：液體和固體發(fā)酵 根據(jù)微生物生長 特性區(qū)分：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵 發(fā)發(fā) 酵酵 的的 一一 般般 流流 程程 (1)用作培養(yǎng)菌種及擴大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制； (2)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌； (3)將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中； (4)將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產(chǎn)物； (5)將產(chǎn)物抽提并進行提純，以得到合格的產(chǎn)品； (6)回收或處理發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢物和廢水。 （ 2）氮源 作用： 氮源主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。 ① 培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟的合成。 4 滅菌與消毒的區(qū)別 滅菌： 用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中 所有微生物 ，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子，殺滅率%以上。 （ 3）蒸汽滅菌的原理： 每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍。 培養(yǎng)基滅菌工藝 (1)分批滅菌操作，間歇滅菌 ,實罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后 維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。 5）對壓力要求高，一般為 MPa。 靜電引力：有一定作用。 發(fā)酵工藝的放大，一般要經(jīng)過 實驗室、中間工廠 (或稱中試車間 )和 生產(chǎn)工廠 3 個步驟。而采用罐發(fā)酵