【正文】 pH 值對(duì)工程菌生長(zhǎng)和表達(dá)的影響 在相同通氣量和攪 拌速度下， pH 值對(duì)不同菌群生長(zhǎng)影響不大，而對(duì)外源蛋白表達(dá)有一定影響 偏堿性的 pH對(duì)外源蛋白的表達(dá)不利，因此，表達(dá)開(kāi)始要調(diào)節(jié) pH 在 之間，以保證外源蛋白的高水平表達(dá)。但這類方法只適用于小分子底物。適用于多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)。 （五）共價(jià)偶聯(lián)法：利用酶表面的反應(yīng)基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無(wú)機(jī)或有機(jī)載體反應(yīng)，形成共價(jià)鍵將酶固定。 單菌固態(tài)純種發(fā)酵 是在純培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，對(duì)于選育良種、保持生理活性和代謝過(guò)程中的穩(wěn)定起很大作用。 （ 2）固態(tài)發(fā)酵的形式 固態(tài)發(fā)酵可分為自然富集固態(tài)發(fā)酵、強(qiáng)化微生物混合固態(tài)發(fā)酵、限定微生物混合固態(tài)發(fā)酵和單菌固態(tài)純種發(fā)酵。 （ 1）恒化培養(yǎng)：使培養(yǎng)基中限制性基質(zhì)的濃度保持恒定； （ 2）恒濁培養(yǎng)：使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定。 在此 過(guò)程中只有料液的加入沒(méi)有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開(kāi)始時(shí)有所增加。改變的主要參數(shù)有菌體繁殖代數(shù)、種子的形成、培養(yǎng)基的滅菌、通氣和攪拌，以及熱傳遞等 3 放大的方法 從小規(guī)模的操作條件到大規(guī)模的放大過(guò)程，主要以 單位體積輸入功率相等 和 保持 K Lα 值不變 為基礎(chǔ) 微生物技術(shù)應(yīng)用 10 進(jìn)行。由于 K d 值不同，使各自培養(yǎng)液中溶解氧的濃度也不同、因而對(duì)菌體代謝會(huì)產(chǎn)生重要的影響。一 .種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)和培養(yǎng)類型 ： ： ①液體培養(yǎng)法 ：液體試管、三角瓶搖床震蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)； ②表面法培養(yǎng)： 液體表層，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培 養(yǎng)。 介質(zhì)過(guò)濾 ：捕集粒子及各種微生物。營(yíng)養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。 致死溫度 ： 殺死微生物的極限溫度。 化學(xué)滅菌劑： 氧化劑類等，鹵化物類，有機(jī)化合物等。 ④ 所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。 有機(jī)氮源 成分復(fù)雜： 除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子。 來(lái)源 糖類、油脂、有機(jī)酸、正烷烴 工業(yè)上常用的糖類： ① 葡萄糖 ： 所有的微生物都能利用葡萄糖，但是會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)； ② 糖蜜：糖蜜是制糖生產(chǎn)時(shí)的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的 副產(chǎn)物。但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA 為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。 重組 DNA分子導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組 DNA 分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。 （五） 基因工程育種 是指利用 DNA 重組技術(shù) 將 外源基因 導(dǎo)入到 微生物細(xì)胞 ，使后者獲得前者的某些 優(yōu)良性狀 或表達(dá)前者的 基因產(chǎn)物 而獲得 新種 。 擴(kuò)大重組的親本范圍 原生質(zhì)體由于完全或部分去除了細(xì)胞壁，能實(shí)現(xiàn)常規(guī)雜交無(wú)法做到的 種種 間間 、 屬屬 間間 、 門門 間間 等遠(yuǎn)緣雜交。 雜交育種的方式因?qū)嶒?yàn)菌株的生殖方式不同而異，如有性雜交、準(zhǔn)性重組、原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化等；但是，選擇親株、分離群體后代的培養(yǎng)、擇優(yōu)去劣和雜種遺傳分析的過(guò)程基本是相同的。搖瓶與發(fā)酵罐的條件較為接近，所測(cè)得的數(shù)據(jù)就更有實(shí)際意義。 復(fù)篩的目的： 確認(rèn)符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。 出發(fā)菌株應(yīng)具備： ① 對(duì)誘變劑的敏感性高； ② ②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力。 一般培養(yǎng)在 30 ℃下。 第三節(jié) 菌種改良 一一 、 菌菌 種種 改改 良良 的的 方方 法法 ：： 自自 然然 選選 育育 、 誘誘 變變 育育 種種 、 雜雜 交交 育育 種種 和和 基基 因因 工工 程程 育育 種種 。 干土噴射法： 又稱干法分離?？上葘⑼翗蛹訜岬?80℃或在 50%乙醇溶液中浸泡 1h，殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再進(jìn)行分離。 三、 增殖（富集）： 富集的目的： 讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)，使篩選變得可能。 2 采樣： 有針對(duì)性地采集樣品。 微生物技術(shù)的特點(diǎn) ：需要多學(xué)科的指示，既多學(xué)科性質(zhì)。 3 工業(yè)上重要放線菌屬： 鏈霉菌屬 、 諾卡氏菌屬 、 小單胞菌屬 、 鏈孢囊菌屬 四、 真核微生物 凡是細(xì)胞核 具有核膜、能進(jìn)行有絲分裂、細(xì)胞質(zhì)中存在線粒體或同時(shí)存在葉綠體等細(xì)胞器的微小生物，都稱為真核微生物。 二、 樣品采集 采樣對(duì)象 —— 土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，但總體來(lái)講 土壤樣品的含菌量最多。 分離放線菌時(shí)，可將樣品液在 40℃恒溫預(yù)處理 20 分鐘 ，有利于 孢子的萌發(fā) ，可以較大的增加放線菌數(shù)目，達(dá)到富集的目的。 1． 常用的分離方法 ：水懸浮稀釋法、干土噴射法、孢子飛揚(yáng)法。 高通量篩選與自動(dòng)化： 高高 通通 量量 篩篩 選選 技技 術(shù)術(shù) （ High throughput screening， HTS）， 是將各種模型固定在微孔板（ 96 孔甚至 384 孔），進(jìn)行自動(dòng)稀釋、加樣，并用機(jī)器人讀結(jié)果，用計(jì)算機(jī)記錄、計(jì)算、整理分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使篩選從繁重的勞動(dòng)中解放出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了篩選的快速、準(zhǔn)確、微量、重現(xiàn)性高和大規(guī)?；? 誘誘 變變 育育 種種 與與 其其 他他 育育 種種 方方 法法 相相 比比 ， 具具 有有 操操 作作 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 便便 、 突突 變變 率率 高高 、 突突 變變 譜譜 廣廣 的的 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) ， 它它 不不 僅僅 能能 提提 高高 產(chǎn)產(chǎn) 量量 ， 改改進(jìn)進(jìn) 質(zhì)質(zhì) 量量 ， 還還 可可 擴(kuò)擴(kuò) 大大 產(chǎn)產(chǎn) 品品 品品 種種 和和 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 化化 工工 藝藝 條條 件件 ， 至至 今今 仍仍 是是 一一 種種 重重 要要 的的 、 廣廣 泛泛 應(yīng)應(yīng) 用用 的的 微微 生生 物物 育育 種種 方方 法法 。 化化 學(xué)學(xué) 誘誘 變變 劑劑 中中 使使 用用 最最 多多 、 最最 有有 效效 的的 是是 烷烷 化化 劑劑 。 （ 2）誘變處理方式 單一因子處理 復(fù)合因子處理：兩種以上因素先后使用、同時(shí)使用或單一因子重復(fù)使用 變株篩選 菌種經(jīng)誘變處理后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的突變類型，需要選擇一定的篩選方式，將具有所需性狀的突變株篩選出來(lái)。 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等。 （（ 四四 ）） 雜雜 交交 育育 種種 不同基 因型 的品系或種屬間，通過(guò) 交配 或 體細(xì)胞融合 等手段形成 雜種 ，或者是通過(guò) 轉(zhuǎn)化 和轉(zhuǎn)導(dǎo) 形成 重組體 ，再?gòu)倪@些雜種或重組體或是它們的后代中 篩選優(yōu)良菌種 。 原生質(zhì)體融合育種技術(shù) 原生質(zhì)體 （ Protoplast）：采用一定方法技術(shù)去掉細(xì)胞壁，剩下的細(xì)胞部分稱之為原生質(zhì)體。 4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。 目的基因與載體連接 獲得目的 DNA 片段和載體 DNA 片段后，要把兩者連接起來(lái)形成重組體。 轉(zhuǎn)染和感染： 利用噬菌體 DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。 空氣 空氣凈化處理 保藏菌種 斜面活化 擴(kuò)大培養(yǎng) 種子罐 主發(fā)酵 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 產(chǎn)物分離純化 成品 滅菌 微生物技術(shù)應(yīng)用 7 發(fā)發(fā) 酵酵 類類 別別 ：： 根據(jù)對(duì)氧的需要區(qū)分：厭氧和有氧發(fā)酵 根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀區(qū)分：液體和固體發(fā)酵 根據(jù)微生物生長(zhǎng) 特性區(qū)分：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵 發(fā)發(fā) 酵酵 的的 一一 般般 流流 程程 (1)用作培養(yǎng)菌種及擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制； (2)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌； (3)將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中； (4)將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長(zhǎng)并形成代謝產(chǎn)物； (5)將產(chǎn)物抽提并進(jìn)行提純，以得到合格的產(chǎn)品； (6)回收或處理發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的廢物和廢水。 （ 2）氮源 作用： 氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。 ① 培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟(jì)的合成。 4 滅菌與消毒的區(qū)別 滅菌： 用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中 所有微生物 ，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子，殺滅率%以上。 （ 3）蒸汽滅菌的原理： 每一種微生物都有一定的最適生長(zhǎng)溫度范圍。 培養(yǎng)基滅菌工藝 (1)分批滅菌操作，間歇滅菌 ,實(shí)罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后 維持一段時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。 5）對(duì)壓力要求高，一般為 MPa。 靜電引力：有一定作用。 發(fā)酵工藝的放大，一般要經(jīng)過(guò) 實(shí)驗(yàn)室、中間工廠 (或稱中試車間 )和 生產(chǎn)工廠 3 個(gè)步驟。而采用罐發(fā)酵