[自然科學(xué)]免疫學(xué)試驗技術(shù)-免費閱讀
【正文】 被 DEAE纖維素吸附的其它球蛋白，可用逐漸增加洗脫液中鹽離子的濃度或降低 pH的方法將其逐一洗脫。蛋白質(zhì)分子量越大沉淀所需鹽濃度越低。 ? B、弗氏佐劑 （ Freund,s adjuvant ， FA） ? 弗氏不完全佐劑和完全佐劑 ? 配方： 礦物油（石蠟油） 3份 乳化劑（羊毛脂、吐溫 80等） 1份 磷酸緩沖液（ PBS） 4份 在此混合物中加入卡介苗（ 12mg/ml),即為 弗氏完全佐劑 ? B弗氏完全佐劑（ Freund,s plete adjuvant， FCA） 在 FIA中加入卡介苗 12mg/ml；或滅活的分支桿菌 10mg/ml。 弗氏佐劑免疫的基本步驟 ? 基礎(chǔ)免疫： 首次，抗原用量大，用弗氏完全佐劑（ Complate Freund’ adjuvand ,含礦物油 ,卡介苗等 ). ? 加強免疫： 第 2次以后，抗原量減半，多次，間隔 24周，用弗氏不完全佐劑 (Inplate Freund’ adjuvand , 不含卡介苗 ). 常用的佐劑 ① 不溶性鹽類膠體佐劑： 氫氧化鋁膠、明礬等。 ? 一般可分為基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段。 放射性核素標(biāo)記技術(shù) 原理： Ag+AbR AgAbR 用液相閃爍儀測 R放出的射線量 特點：敏感性極高，但需高級閃爍儀， 且同位素對人有放射性危害。 （ 7）應(yīng)用鹽析、透析法、凝膠過濾法除去未結(jié)合的 HRP。 用 過碘酸鈉 活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。 肝臟 胸腺 肺臟 法氏囊 腸道 脾臟 食道 ●熒光抗體技術(shù) 酶標(biāo)抗體 ? 酶標(biāo)抗體 是指與底物結(jié)合后能顯色的 酶 與 抗體連接后所制備的結(jié)合物。 ⑤ 應(yīng)用透析法、鹽析、凝膠過濾法除去未結(jié)合的游離熒光素。 熒光抗體的標(biāo)記 ? （１）免疫球蛋白（ IgG ）的提?。?硫酸銨鹽析法、 DEAE纖維素提取法。 如細(xì)菌、寄生蟲的浸出液、組織浸出液、培養(yǎng)濾液、動物血清等，與相應(yīng) Ab相遇后在有電解質(zhì)存在下 AgAb復(fù)合物相互交聯(lián)形成免疫復(fù)合物達(dá)一定大時，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀反應(yīng)。 ? 間接凝集試驗 將可溶性抗原或抗體結(jié)合在一種與免疫無關(guān)的惰性微粒表面，然后與相應(yīng)的抗體或抗原作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，微粒即可被動的被凝集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 橋梁凝集試驗 又稱 Coombs抗球蛋白試驗，用于檢測不完全抗體。 ? 檢測系統(tǒng) Ag + Ab AgAb AgAb補體 + 補體 紅細(xì)胞 + 溶血素 紅 溶 指示系統(tǒng) （不溶血，陽性） 紅 溶 補體 （溶血，陰性） 4. 標(biāo)記抗體技術(shù) 標(biāo)記抗體技術(shù)是在抗體球蛋白分子上，連接某一個特定的、容易檢測的分子或原子 (標(biāo)記物 )，利用標(biāo)記抗體能與相應(yīng)抗原結(jié)合的特性，通過標(biāo)記物的檢測，從而確定抗原的存在部位。 ? ④避光以電磁攪拌器攪拌，其反應(yīng)時間與溫度有關(guān)。 ? 間接法 ? 制片：同直接法 ? 染色： 染色時 ， 標(biāo)本先滴加抗血清 ， 在37℃ 處理 30～ 60min； ? 用 PBS充分洗滌后 ， 再用熒光標(biāo)記的抗抗體染色 ， 37℃ 30～ 60min， 洗滌 ， 封固 。 辣根過氧化物酶（ HRP）常用的底物： 鄰苯二胺（ OPD）： 反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性 四甲基聯(lián)苯胺（ TMB）： 反應(yīng)后呈藍(lán)色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。 (4) 加 20μl 碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的 RP的 PH升高到 ～ ，然后立即加入 10mg IgG(抗體 )在 1ml ，室溫避光輕輕攪拌 2小時。 ? 競爭法： 用抗體被覆 ， 加一定量的標(biāo)記抗原和待檢抗原混合物 ， 二者競爭與板上的抗體結(jié)合 ， 顯色后與加標(biāo)記抗原的對照組比較 ， 試驗孔顏色顯著低于對照孔者為陽性孔 ， 待檢抗原含量越高 ， 顏色越淺 ， 此法適于小分子抗原或半抗原的檢測 。 （ BALB/C,昆明鼠） ? 大鼠（ rat）：可用于自制
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