標記物及其與抗原抗體的結合物制備-免費閱讀
【正文】 常用的雙功能交聯(lián)法有：碳二亞胺縮合法、戊二醛法、 N羥基琥珀亞酰胺活化法、混合酸酐法、過碘酸鹽氧化法、 N琥珀酰亞胺基 3(2吡啶基二硫 )丙酸醋(SPDP)法等 。 這種結合過程主要是物理吸附作用，不影響被標記分子的生物活性 。 溶液中未反應的小分子，如偶聯(lián)劑、抗體、量子點分解產(chǎn)物等可采用透析法去除 。針對小分子半抗原，則需先將半抗原與大分子載體蛋白（牛血清白蛋白、多聚賴氨酸等）連接，再標記 EU3+。 第六節(jié) 化學發(fā)光劑與抗原抗體的結合物制備 一、基本方法 化學發(fā)光劑 標記反應分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方式 ： 直接偶聯(lián)是通過偶聯(lián)反應，使標記物分子中的發(fā)光集團直接連接到被標記物分子的反應基團上 。 二、酶標記結合物純化 標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度。 一步法是將抗體 (抗原 )、酶和戊二醛同時發(fā)生反應。 三、熒光素標記結合物純化 熒光抗體的純化 去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物： 透析或凝膠過濾 去除熒光素未結合和結合過度的抗體： 陰離子交換層析法 去除交叉反應或非期望抗體： 動物肝粉吸收或固相抗原吸收 熒光素標記結合物鑒定 熒光抗體的鑒定 熒光素與蛋白結合率 F/P= 抗體效價：雙向免疫擴散試驗 抗體特異性：吸收試驗、抑制試驗 保存： 20℃ ：保存 1年～ 2年 真空干燥：長期保存 nmnm AAA4 9 52 8 04 9 5 n m???第五節(jié) 酶與抗原抗體的結合物制備 一般是通過交聯(lián)劑將酶與抗體或抗原相結合 。 標記方法 : 攪拌法：適于標記體積較大、蛋白含量較高的抗體。免疫活性測定方法，用少量標記物與過量抗體反應，測定與抗體結合部分（ B）的放射活性，并計算與加入的標記物總放射活性（ T）的百分比（ B/T） 。 交聯(lián)的程度容易測定，交聯(lián)后的大分子生物活性高于一般交聯(lián)劑方法 。 過碘酸鈉氧化法 利用過碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，再通過醛基與標記物分子中的伯氨基反應形成schiff堿，后者經(jīng) NaBH4還原 — N＝ C— 鍵成為穩(wěn)定的結合物 。 均一的雙功能交聯(lián)劑，其兩個反應基團相同 。 常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、維生素 C、白磷、硼氫化鈉等 。 無機殼層修飾法 合成核 /殼結構的量子點，如在 CdSe量子點的外面包覆一層 CdS 或 ZnS 就構成了以 CdSe為核，以 CdS 或 ZnS 為殼的量子點。 具有 “ 調(diào)色 ” 功能，一元激發(fā)多元發(fā)射 不同粒徑的量子點具有不同的顏色，可用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點，獲得多種標記顏色 。 發(fā)光過程快速， 1秒內(nèi)光子散射達高峰，整個過程在 2秒內(nèi)完成 。 熒光 AP 360nm 激發(fā)光 H3PO4 + β Gal 熒光底物 β Gal 的底物 4甲基傘酮基 β D半 乳糖苷（ 4MUG ） 酶作用后，生成高強度熒光物 ，用熒光計測量。 三、酶和酶作用底物 常用的酶標記物有 辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) β 半乳糖苷酶 (β galactosidase, β Gal) 每種酶可與相應的顯色或發(fā)光底物作用，產(chǎn)生典型的有色反應物或化學發(fā)光反應，通過反應的顏色或發(fā)光強度對被檢物進行定性、定量分析 。 銪是標記抗原抗體應用最廣的元素 。 游離的稀土離子熒光比較弱，但與適當?shù)尿蟿┤?β 萘甲酰三氟丙酮（ β NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（ PTA）等形成螯合物后，可使熒光得到增強 。 辣根過氧化物酶 HRP 辣根過氧化物酶（ HRP） 糖蛋白（主酶） 亞鐵血紅素（輔基） 主酶與酶活性無關 輔基是酶的活性中心 RZ值： 403nm （輔基） 與 275nm（主酶） OD值之比 RZ值與酶活性無關，酶活性單位比 RZ值更為重要 ELISA中應用最為廣泛的標記用酶 堿性磷酸酶 ALP及 β 半乳糖苷酶 堿性磷酸酶（ AP） 菌源性 AP 腸粘膜 AP β –半乳糖苷酶（ β Gal） 用于均相酶 免疫測定 HRP底物 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H 2O HRP 供氫體 DH2習慣上被稱為底物，底物有多種 H2O2為受氫體， HRP對受氫體的專一性很高 HRP的常見底物 鄰苯二胺 OPD 四甲基聯(lián)苯胺 TMB 5氨基水楊酸 5ASA 2,2′ 氨基 二 (3乙基 苯并噻唑啉磺酸 6)銨鹽 ABTS 常用底物 OPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長 492nm。 常用 4甲基傘酮基 β D半乳糖（ 4methylumbelliferyβ Dgalactoside， 4MUG）作為底物，酶促反應后，產(chǎn)生高強度熒光物質(zhì) 4甲基傘形酮（4MU） 。 電化學發(fā)光劑 是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)。 激發(fā)光波長寬，而發(fā)射光波長窄 量子點的激發(fā)光波長范圍很寬，具有較大的 Stokes位移和狹窄對稱的熒光譜峰 。 化學修飾法 用含巰基的有機分子如二氫硫辛酸、巰基乙酸和聚乙二醇等對量子點進行表面修飾 。 根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強弱，可以制備 ～ 150nm不等的膠體金顆粒 。 非均一的雙功能交聯(lián)劑，兩個反應基團不同，每個基團可能于不同的條件下反應 。 N羥基琥珀酰亞胺活化法 蛋白質(zhì)分子羧基通過 N羥基琥珀亞酰胺活化，再與標記物分子中的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵 。 可通過
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1