標記物及其與抗原抗體的結合物制備(文件)
【正文】 離子層構成 (內(nèi)層為負離子層 AuCl2，外層是帶正電荷的 H+)。 膠體金制備原理 膠體金是氯金酸 (HAuCl4)在還原劑的作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電荷的疏水膠溶液。 金溶膠顆粒的直徑取決于制備時加入的枸櫞酸三鈉量，保持其他條件不變，制備時加入不同劑量的檸檬酸三鈉可獲得不同粒徑的膠體金顆粒 。 交聯(lián)劑類型 根據(jù)其兩個反應基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑 。 一、 均一的雙功能交聯(lián)劑 常用的 均一的雙功能交聯(lián)劑（ homobifunctional crosslinking reagent） 有戊二醛、碳二亞胺等 。 戊二醛法 戊二醛分子中兩個醛基可分別與兩個相同或不同分子上的伯氨形成 Schiff 堿 , 將兩個生物大分子以五碳鏈的橋連接起來 。 SPDP分子兩端分別含有對脂肪鏈上的巰基和伯氨基十分敏感，有專一作用的二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基，可將含巰基和氨基的兩種蛋白質(zhì)很容易地交聯(lián)起來；如果兩種蛋白質(zhì)不含巰基，可用 SPDP在其中一個蛋白質(zhì)分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巰基蘇糖醇（ DTT）還原成游離巰基，最后使二者交聯(lián)起來。 SPDP交聯(lián)法優(yōu)點 對蛋白質(zhì)的伯胺基和脂肪族鏈上的游離巰基反應敏感，專一性很強，反應容易控制，可避免副反應 。 125I ChT氧化 125I或 125I+ 取代反應 125I標記物 （混合物） 氯胺 T(chT)法 ?使用無還原劑的高比放射性碘源 ?chT用量要低 ?控制總反應體積200μ l ?反應時間 1分鐘～2分鐘 ?弱堿性反應條件 二、放射性核素標記結合物的純化 標記反應后形成的結合物不能直接使用，需去除游離 125I和其他雜質(zhì) 。 免疫活性指標記物與抗原或抗體反應的能力。標記物長期貯存后可因脫碘和自身輻射造成蛋白質(zhì)破壞而形成碎片，同樣可以采用上述方法對標記物重新進行純化。 FITC標記結合物制備 熒光素標記抗體的方法 原理 :利用抗體蛋白的 自由氨基 與 FITC的 異硫氰基在堿性溶液中形成 硫碳酰胺鍵 ，使抗體與 FITC結合成熒光抗體。標記比較勻，非特異染色較低。本法簡便快捷，可在數(shù)小時內(nèi)完成 。 一、基本方法 制備方法 過碘酸鈉法（直接法） 常用于 HRP標記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法 戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與 HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結合。 戊二醛法又根據(jù)試劑加入的方法分為一步法和二步法。 戊二醛交聯(lián)法 二步法則是將相對過量的戊二醛與酶反應，讓酶分子上的氨基僅與戊二醛上的醛基結合，不發(fā)生酶與酶之間的結合，除去未與酶結合的多余戊二醛后，再加入抗體 (抗原 )，形成酶 戊二醛 抗體 (抗原 )結合物。 為防止酶蛋白分子中氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)反應，標記前需用 2,4二硝基氟苯封閉酶蛋白分子中殘存的 α 氨基和ε 氨基 。 沉淀線經(jīng)生理鹽水反復漂洗后，滴加的底物溶液，若能在沉淀線上顯色，則表示酶標記物中的酶仍具有活性。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。 三、 化學發(fā)光劑標記結合物的鑒定 由于標記過程的不規(guī)范或存放過程中可能出現(xiàn)的脫落現(xiàn)象，對新制備已純化或經(jīng)長時間保存的結合物，在使用前均需測定蛋白質(zhì)的含量、免疫學活性和發(fā)光效率等三項指標，以保證實驗結果準確、可靠 。 螯合劑可先螯合 EU3+，再連接蛋白質(zhì)（一步法），或先連接蛋白質(zhì)，再螯合 EU3+(二步法 )。 量子點表面含有羧基的偶聯(lián)方法主要是混合酸酐法和碳二亞胺法 。 多余的抗體可采用凝膠柱層析法或 50%飽和硫酸銨沉淀提純法去除 。 偶聯(lián)前后量子點的紫外 可見吸收光譜和熒光光譜特征的變化、 SDSPAGE凝膠電泳、熒光鏡下成像等，可證明結合物偶聯(lián)成功 。 吸附的可能機理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性，其表面的負電荷能與蛋白質(zhì)的正電荷基團靜電吸附而牢固結合 。 本章小結 臨床免疫分析技術常用的標記物有放射性核素、熒光素、酶、化學發(fā)光劑、膠體金、量子點、三價稀土離子等 。 根據(jù)其兩個反應基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑。 Thank you ! 。 本章小結 標記結合物的純化方法主要有凝膠柱層析、透析、硫酸銨沉淀法、離心法等，也可以采用高效液相層析、電泳及離子交換柱層析進行分離純化 。 量子點由 IIVI族或 IIIV族元素組成，其光學特性為：激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對稱，發(fā)光效率高、光化學穩(wěn)定性好，發(fā)射光顏色與粒徑大小關聯(lián)等 。 二、 膠體金標記結合物的純化 、鑒定 除去未標記的蛋白、未充分標記的膠體金以及在標記過程中形成的聚合物，可采用超速離心法或凝膠過濾法 。 G100葡聚糖凝膠柱可證實結合物偶聯(lián)的有效性 。 不同偶聯(lián)比例量子點探針的分離，可根據(jù)顆粒大小不同，其進一步純化可以采用凝膠過濾法、高效液相色譜等方法進行分離 。 表面功能基團為羥基的量子點偶聯(lián)主要通過琥珀酸酐法實現(xiàn) 。 第八節(jié) 量子點與抗原抗體結合物制備 一、 基本方法 量子點與抗原、抗體等生物分子偶聯(lián)的方法主要有 靜電吸附法、生物素 親和素法及共價結合法 。 第七節(jié) 稀土離子與抗原抗體的結合物制備 一、基本方法 鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體分子結合，需利用具有雙功能基團的螯合劑 。 間接偶聯(lián)是通過交聯(lián)劑在標記物和被標記物之間插入一條鏈或一個基團，通過 “ 橋 ” 可以在原有結構中引進新的活性基團，增加反應活性，減弱偶聯(lián)雙方分子結構中存在的空間阻礙效應 。 四、酶標記結合物的保存 酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當，極易失活。 常用的純化方法： 葡聚糖凝膠 G200/G150過柱層析純化 50%飽和硫酸銨沉淀提純 三、酶標記結合物鑒定 每批制備的酶標記物都要進行質(zhì)量和標記率的鑒定，質(zhì)量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性的鑒定 。 改良過碘酸鈉法 此法是目前用于 HRP標記抗體或抗
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1