【正文】 還原裂解使其再生 。 125I結(jié)合物鑒定 標(biāo)記物質(zhì)量 ?高純度 ?高比放射活性 ?完整免疫活性 放射化學(xué)純度 ?單位標(biāo)記物中結(jié)合于抗原或抗體上的放射活性占該標(biāo)記物總放射性的百分比 ?應(yīng)大于 95% 免疫活性（ immunoreactivity） ?標(biāo)記物與抗原或抗體結(jié)合的能力 ?標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比 ?該值越大 , 標(biāo)記物免疫活性好 四、放射性核素標(biāo)記結(jié)合物的保存 放射性核素標(biāo)記結(jié)合物在 2~8℃ 避光保存。標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。 交聯(lián)方法主要有：戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法等 。此法操作簡便，可用于 HRP、 ALP標(biāo)記抗體 (抗原 )。 常用的純化方法： 葡聚糖凝膠 G200/G150過柱層析純化 50%飽和硫酸銨沉淀提純 三、酶標(biāo)記結(jié)合物鑒定 每批制備的酶標(biāo)記物都要進(jìn)行質(zhì)量和標(biāo)記率的鑒定，質(zhì)量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性的鑒定 。 間接偶聯(lián)是通過交聯(lián)劑在標(biāo)記物和被標(biāo)記物之間插入一條鏈或一個(gè)基團(tuán)，通過 “ 橋 ” 可以在原有結(jié)構(gòu)中引進(jìn)新的活性基團(tuán)，增加反應(yīng)活性，減弱偶聯(lián)雙方分子結(jié)構(gòu)中存在的空間阻礙效應(yīng) 。 第八節(jié) 量子點(diǎn)與抗原抗體結(jié)合物制備 一、 基本方法 量子點(diǎn)與抗原、抗體等生物分子偶聯(lián)的方法主要有 靜電吸附法、生物素 親和素法及共價(jià)結(jié)合法 。 不同偶聯(lián)比例量子點(diǎn)探針的分離，可根據(jù)顆粒大小不同，其進(jìn)一步純化可以采用凝膠過濾法、高效液相色譜等方法進(jìn)行分離 。 二、 膠體金標(biāo)記結(jié)合物的純化 、鑒定 除去未標(biāo)記的蛋白、未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過程中形成的聚合物，可采用超速離心法或凝膠過濾法 。 本章小結(jié) 標(biāo)記結(jié)合物的純化方法主要有凝膠柱層析、透析、硫酸銨沉淀法、離心法等，也可以采用高效液相層析、電泳及離子交換柱層析進(jìn)行分離純化 。 根據(jù)其兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑。 吸附的可能機(jī)理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性，其表面的負(fù)電荷能與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)靜電吸附而牢固結(jié)合 。 多余的抗體可采用凝膠柱層析法或 50%飽和硫酸銨沉淀提純法去除 。 螯合劑可先螯合 EU3+，再連接蛋白質(zhì)（一步法），或先連接蛋白質(zhì)，再螯合 EU3+(二步法 )。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時(shí)間保存。 為防止酶蛋白分子中氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)反應(yīng)，標(biāo)記前需用 2,4二硝基氟苯封閉酶蛋白分子中殘存的 α 氨基和ε 氨基 。 戊二醛法又根據(jù)試劑加入的方法分為一步法和二步法。本法簡便快捷，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成 。 FITC標(biāo)記結(jié)合物制備 熒光素標(biāo)記抗體的方法 原理 :利用抗體蛋白的 自由氨基 與 FITC的 異硫氰基在堿性溶液中形成 硫碳酰胺鍵 ，使抗體與 FITC結(jié)合成熒光抗體。 免疫活性指標(biāo)記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力。 SPDP交聯(lián)法優(yōu)點(diǎn) 對蛋白質(zhì)的伯胺基和脂肪族鏈上的游離巰基反應(yīng)敏感，專一性很強(qiáng)，反應(yīng)容易控制，可避免副反應(yīng) 。 戊二醛法 戊二醛分子中兩個(gè)醛基可分別與兩個(gè)相同或不同分子上的伯氨形成 Schiff 堿 , 將兩個(gè)生物大分子以五碳鏈的橋連接起來 。 交聯(lián)劑類型 根據(jù)其兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑 。 膠體金制備原理 膠體金是氯金酸 (HAuCl4)在還原劑的作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電荷的疏水膠溶液。 量子點(diǎn)表面修飾 無機(jī)殼層修飾法和化學(xué)修飾法是兩種常用的量子點(diǎn)修飾方法 。有機(jī)熒光色素的光漂白速率很快，而量子點(diǎn)的光漂白作用則小得多 。 極其穩(wěn)定，如 2甲基吖啶酯，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其有效期長達(dá) 1 年甚至更久 。 常用底物 BCIP/ NBT常用于 ELISPOT中的 PVDF膜顯色，在 ALP的催化作用下， BCIP被水解生成強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物與 NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色沉淀 4MUP被 AP催化生成 4甲基傘形酮，在 360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出 450nm的熒光，可用熒光光度計(jì)進(jìn)行測量。 其他如堿性磷酸酶的底物（ 4甲基傘酮磷酸鹽）和辣根過氧化物酶的底物（對羥基苯乙酸）等，都具有熒光底物的性質(zhì) 。 二、 熒光物質(zhì) 有機(jī)化合物熒光素 稀土離子螯合物 熒光底物（酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)） 熒光素 異硫氰酸熒光素（ fluorescein isothiocyanate, FITC） 四乙基羅丹明（ rhodamine, RB200） 四甲基異硫氰酸羅丹明（ tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC） 藻紅蛋白 (phycoerthrin, PE) 常用的熒光素特性 熒光物質(zhì) 最大吸收光譜 最大發(fā)射光譜 應(yīng)用 異硫氰酸熒光素 (FITC) 490～ 495nm 520～ 530nm （黃綠色） FAT、熒光偏振免疫測定 四乙基羅丹明 (RB200) 570～ 575nm 595～ 600nm（橙紅色） FITC的襯比染色或雙標(biāo)記 FAT 四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC) 550nm 620nm（橙紅色） FITC的襯比染色或雙標(biāo)記 FAT 藻紅蛋白（ PE） 490560nm 595nm（紅色） 雙標(biāo)記 FAT、流式細(xì)胞術(shù) 稀土離子 鑭系元素屬于三價(jià)稀土離子，包括銪（ Eu3+）、釤（Sm3+）、鋱 (Tb3+)、釹（ Nd3+）、鏑（ Dy3+）和鈰 (Ce3+)等。 稀土離子的 熒光特性 如下： 具有較大的 Stokes位移，發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不會相互重疊。不穩(wěn)定，致癌性。 四、化學(xué)發(fā)光劑 在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為 化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物 。 特點(diǎn)：①反應(yīng)在電極進(jìn)行； ②電子供體為：三丙胺（ TPA） ③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕 三聯(lián)毗啶釕 分子結(jié)