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Materials Science amp。總之，將殼聚糖納米粒子作為藥物載體是具有廣闊的應用前景的研究方向。第五章 總結與展望 總結本文使用乳化交聯法制備殼聚糖納米粒子，考察了影響其質量的五種因素，并通過負載SeC研究投藥量對包載性能的影響。通過圖22A可以看出，殼聚糖納米粒子里包入了SeC，粒徑大約在400500 nm左右，與納米粒度儀得到的粒徑大約相符。它的特點是靈敏度高、經濟。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。因此，在制備載藥殼聚糖納米粒子時，要考慮投藥量對載藥率和包封率的影響。 TEM分析TEM結果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。①水相的配制殼聚糖溶液的配置：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖375mg溶于25 ml 2% 醋酸溶液中配制成濃度為15 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。通過各種表征方法分析各因素對殼聚糖納米粒子形成的粒徑與形貌的影響。 sizes(E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% (2)TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizes②不同交聯劑濃度，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯劑的濃度有關。殼聚糖濃度較大，納米粒子間粘連現象嚴重，造成產物粒徑大。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時分子較大，最終造成交聯得到的粒子粒徑也變大。當乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯固化后形成的納米粒子粒徑較小，且分布均勻，TEM成像時襯度足夠，故磷鎢酸染色后，仍呈黑色圓球。結果表明，控制span80的用量為油相體積的3%可以取得粒徑較小的產物。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯固化后的產物呈圓球狀。表24 油水比對納米粒子粒徑的影響Table 24Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles 39。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，%，1%，3%，5%，7%的戊二醛作為交聯劑進行化學交聯，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。(4)不同殼聚糖濃度的選擇水相：分別稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度分別為10 mg/mL，15 mg/mL，20 mg/mL，25 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。(2)不同油水比的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 實驗方法稱取CS溶于2%乙酸溶液中，攪拌使其溶解后備用。其依據的光學原理為Fraunhofer衍射和Mie散射理論，因此相應的激光粒度分析儀分為激光衍射式和激光動態(tài)散射式兩類。 創(chuàng)新點通過以CSNPs為載體，有效增強SeC的體外抗腫瘤活性，并顯著縮短SeC對MCF7起作用的時間。Alexakis等制備了小牛胸腺DNA海藻酸酯納米粒子，外面包覆殼聚糖制成載藥納米粒子后經過胃腸道時藥物不被破壞，60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。徐海濤等觀察了殼聚糖順鉑緩釋納米粒子對C6膠質瘤大鼠瘤內化療的療效，結果表明，殼聚糖順鉑納米粒子毒性小，安全性較高，療效可靠。經沙鼠動物實驗發(fā)現，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。溶劑蒸發(fā)法又稱液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據聚合物與藥物的性質制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機溶劑擴散進入連續(xù)相并通過連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)，納米粒子固化，并經過處理最終得到載藥納米粒子的過程[32]。Wang等在溫和的條件下通過界面聚合法一步制備多糖多肽復合空心納米粒子。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當液體通過蠕動泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子[33]。近幾年殼聚糖納米粒子的制備和應用成為研究的熱點[31]。 殼聚糖與甲殼素的結構(A) 甲殼素 (B)殼聚糖殼聚糖的每個C6單元均含有一個氨基，兩個自由羥基。但是，通過化學方法合成得到的大部分藥物載體在生物相容性，可降解性以及細胞毒性等方面還存在不盡如意的地方[24]。其中，納米藥物載體在醫(yī)學領域中控釋緩釋的應用極為廣泛，提高藥物的利用率療效和減少藥物的副作用已成為醫(yī)藥研究領域的一項重要課題。納米，是尺寸度量單位，1納米=109 米，相當于4個原子并列的直徑。且SeC對人類正常纖維原細胞Hs68的細胞毒性很小，IC50400 μΜ，毒性遠小于亞硒酸鹽。而相比之下，有機硒化合物吸收率高，生物活性強，毒性低和環(huán)境污染小，不僅能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應上也比無機硒顯著，抗癌作用更強[11]。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金屬，抗逆境等多種生物學活性[8] 。但由于毒性，硒曾被認為是一種對高級生物有害的元素。殼聚糖(CS)是一種優(yōu)良的天然藥物載體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和無毒性,被廣泛地用作醫(yī)藥載體。本文以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯劑，液體石蠟為乳化體系，制備出粒徑小，分散性好，載藥率及包封率較高的SeC殼聚糖納米粒子。1957年美國營養(yǎng)學家Schwarz和Foltz首次用硒治療動物肝壞死取得成功后，硒逐漸明確為動物體內必需的微量元素[2] 。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽過氧化酶（GSHPx）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在，GSHPx能減輕或阻斷自由基所致的脂質過氧化連鎖反應，保護蛋白質、清除自由基和DNA及生物膜的完整性，修復損傷分子部位；同時能提高機體免疫能力，抵抗疾病[9]。其中含硒氨基酸硒代半胱氨酸（selenocysteine）是生物合成和摻入到蛋白質分子中的第21種氨基酸[12]。因此，SeC具有更廣譜高效的抗腫瘤活性，且對正常細胞的毒性較小。 nm內的物質或結構的構造技術，即納米級材料的設計，制造，測量和控制技術[17]。 納米藥物載體的研究進展理想的納米粒載體應是無毒和可生物 的。近年來，生物大分子材料由于其可再生性，無毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點成為藥物載體研究的熱點，于是利用生物大分子材料來制備納米藥物載體的研究應運而生。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。制備殼聚糖納米粒子的方法有多種[32]，其選擇的依據受以下因素影響：①目標粒徑分布；②有效成分的熱化學性質與穩(wěn)定性；③有效成分的釋藥動力學與重現性；④載藥納米粒子的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。納米粒子的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯程度等因素[32]。先將殼聚糖與α氨基NCA（Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量L亮氨酸NCA分散至乙酸乙酯中，并用Span80乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應2 h，經進一步處理可得殼聚糖空心納米粒子[32]。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成W/O型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖納米粒子。Jaganathan等[37]采用乳化交聯法制備了載有破傷風類毒素的殼聚糖納米粒子，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質的活性，納米粒子的包封率也從加入海藻糖前的40%提高到90%。(5)提高疏水性藥物對細胞膜的通透性，增強細胞吸收殼聚糖納米粒子溶脹引起的擴散釋藥過程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對藥物的吸收具有協同促進作用。 課題的研究意義與創(chuàng)新點 課題的研究意義惡性腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病。第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實驗部分 材料與試劑表21實驗試劑Table 21 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產地液體石蠟AR天津市化學試劑公司Span80CP天津市化學試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司甲苯AR天津市百世化工有限公司無水乙醇AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司冰醋酸AR天津市百世化工有限公司實驗用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。但是很多研究證明對于粒徑小于1 μm的顆粒，必須用Mie散射理論求解粒徑分布。取500 μL CS溶液緩慢滴加到含有表面活性劑span80的的液體石蠟中，經超聲處理后形成穩(wěn)定的W/O型微