質(zhì)粒dna制備-預(yù)覽頁
【正文】 糖操縱子 (lac operon)誘導(dǎo)物異丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside， IPTG)的作用下，細菌合成半乳糖苷酶，分解 X— gal，此菌落成為藍色。 三、常用 質(zhì)粒載體 1. pBR322 ? pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長為 4 363bp，由 3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來自 pRSF2124， tetr來自 pSCl01，復(fù)制起始點來自 pM9。 四、質(zhì)粒 DNA的提取和純化 （一）、 質(zhì)粒提取的主要步驟 1．細菌的培養(yǎng)： ? 先分離單個菌落， 接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒 DNA也在自主復(fù)制。 ? 長時間在氯霉素存在下 ， 質(zhì)粒 DNA合成過程中 ， 復(fù)制鏈中會摻入核糖核苷酸 ， 對堿性條件敏感 ， 將會導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀DNA和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生 ． ? 但有些人仍然偏愛用氯霉素選擇性擴增質(zhì)粒 ， 其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量 。 2．細菌的收集與裂解 ? 細胞生長過程中 ， 排出大量代謝產(chǎn)物 ，為了提高質(zhì)粒 DNA的純度 ， 離心棄上清 ，細菌沉淀最好用 STE或生理鹽水懸浮 ，漂洗 l2次 ， 離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細去除干凈 。 CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。 ? 對于 DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實驗，直接用小量或中量提取的 DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。 ? 若一定要用煮沸法提取這類菌株的質(zhì)粒DNA，不管是大量還是小量制備，必須用酚、氯仿反復(fù)抽提幾次．以去除該酶． 2．質(zhì)粒的大小 ? 大于 15kb的質(zhì)粒 DNA易被強烈的物理或化學(xué)作用損壞 ， 所以常選用操作過程較溫和的 SDS法 。 3．細菌染色體 DNA變性條件強弱的控制 ? 堿法是目前實驗室中最常用的質(zhì)粒DNA提取方法 。 如出現(xiàn)這種狀況 ， 在下次提取時 ， 可以適當(dāng)縮短堿變性時間 ， 不必按某些書籍中規(guī)定的 10分鐘時間操作 ． ? ? 在煮沸法中 ， 過長時間 ， 過高熱度也會導(dǎo)致類似問題的出現(xiàn) ， 這種影響實驗結(jié)果的操作細節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株和質(zhì)粒情況加以適當(dāng)改進 。 ? 將 pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下 ， 染色體 DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。 ? 大多數(shù)情況下 ， 用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量制備物中的雜質(zhì) 。
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