浙江大學生物化學實驗甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定-預覽頁
【正文】 子的大小及構(gòu)型的差異 ， 可用電泳的方法對核酸進行分離和鑒定 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 此外 ， 還可了解質(zhì)粒樣品中的雜質(zhì) ， 如 RNA、 染色體 DNA、 蛋白質(zhì)等的污染程度 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ?經(jīng)在 BamHⅠ 和 HindⅢ 切點間連接上一個大小為 ， 即成為重組的 pBSKS質(zhì)粒 。 ? 操作步驟 ?⑴ 、 質(zhì)粒的提取 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 質(zhì)粒提取的操作方法及注意事項解說詳見 P145。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 限制性內(nèi)切酶簡介 ? 限制性內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶 （ Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease） 是指能辨認雙鏈 DNA分子中的特異堿基序列 ， 并在此序列處以內(nèi)切方式將 DNA雙鏈同時切斷的一類酶 。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶廣泛存在于原核生物中 ， 1970年由 。 （ 即旋轉(zhuǎn) 1800后與原來結(jié)構(gòu)相同 ） ， 少數(shù)酶可識別更長的序列或兼并序列 。 常用限制性內(nèi)切酶的酶切位點可參見有關(guān)書藉 。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 如為完全酶切 ， 電泳后應產(chǎn)生這兩個片段的電泳圖譜 ， 由此即可對提取的質(zhì)粒進行鑒定 。 ?（ 3） 、 電泳鑒定 ? 膠濃度： ~% ? 上樣量： 10ul質(zhì)粒 +2ul上樣緩沖液 ? 各步操作方法及注意事項解說詳見 P148 P149 。 ? 根據(jù)定義，在 50 μl體系中， 1 單位的限制性內(nèi)切酶即可在 60 分鐘內(nèi)完全切割 1 μg 的底物 DNA。 ? 對于許多酶，都可以用更少單位的酶消化 16小時。 ? 若消化后的 DNA 需要進行后續(xù)的實驗操作，可用熱失活法終止（ 65℃ 或 85 ℃ 保溫 20~30分鐘 ）。 ? DNA樣品中蛋白含量過高、高濃度的 RNA等對酶切均有影響。 ?內(nèi)切酶 ? 內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應當立即置于冰上。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 但如酶量超過反應體系的 10％時，會造成體系中甘油過量（因 酶 的儲存液中含有 50％的甘油），而使酶產(chǎn)生 Star活性。不需要 BSA的酶如果加了 BSA也不會受太大影響。 ? 常規(guī)酶切中均選用最佳緩沖液進行酶切反應， ? 聯(lián)合酶切時，可根據(jù)廠商提供的聯(lián)合酶切的緩沖液選擇表選擇緩沖液或采用萬能緩沖液。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 當采用聯(lián)合酶切進行實驗時尤其要注意選擇的反應溫度是否都滿足兩者的要求，如果有一個酶的最適溫度不符，建議分步酶切。 ? 若兩者可用同種緩沖液，則可同時水解，否則低鹽濃度的限制酶必須先用，待調(diào)節(jié)鹽濃度后，再用高鹽濃度的限制酶水解。 ? 在酶切時，一般選擇便宜的酶進行酶切沉淀，而后再進行第二個酶的酶切反應。 ?酶切失敗的原因及處理辦法 ? 酶切失敗主要表現(xiàn)為兩方面： ?（ 1） 不完全酶切甚至是 DNA基本未發(fā)生酶切。 ? c、反應時間不夠。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? （ 3）、出現(xiàn)
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