質(zhì)粒dna制備-免費(fèi)閱讀
【正文】 ? 大多數(shù)情況下 ， 用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量制備物中的雜質(zhì) 。 如出現(xiàn)這種狀況 ， 在下次提取時(shí) ， 可以適當(dāng)縮短堿變性時(shí)間 ， 不必按某些書(shū)籍中規(guī)定的 10分鐘時(shí)間操作 ． ? ? 在煮沸法中 ， 過(guò)長(zhǎng)時(shí)間 ， 過(guò)高熱度也會(huì)導(dǎo)致類(lèi)似問(wèn)題的出現(xiàn) ， 這種影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的操作細(xì)節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株和質(zhì)粒情況加以適當(dāng)改進(jìn) 。 ? 若一定要用煮沸法提取這類(lèi)菌株的質(zhì)粒DNA，不管是大量還是小量制備，必須用酚、氯仿反復(fù)抽提幾次．以去除該酶． 2．質(zhì)粒的大小 ? 大于 15kb的質(zhì)粒 DNA易被強(qiáng)烈的物理或化學(xué)作用損壞 ， 所以常選用操作過(guò)程較溫和的 SDS法 。 CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。 ? 長(zhǎng)時(shí)間在氯霉素存在下 ， 質(zhì)粒 DNA合成過(guò)程中 ， 復(fù)制鏈中會(huì)摻入核糖核苷酸 ， 對(duì)堿性條件敏感 ， 將會(huì)導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀DNA和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生 ． ? 但有些人仍然偏愛(ài)用氯霉素選擇性擴(kuò)增質(zhì)粒 ， 其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量 。 三、常用 質(zhì)粒載體 1. pBR322 ? pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長(zhǎng)為 4 363bp，由 3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來(lái)自 pRSF2124， tetr來(lái)自 pSCl01，復(fù)制起始點(diǎn)來(lái)自 pM9。 ? 常用來(lái)作為標(biāo)記的有氨芐青霉素抗性(ampicillin resistance， ampr)基因，此基因編碼 β — 內(nèi)酰胺酶，該酶能水解氨芐青霉素的 β — 內(nèi)酰胺環(huán)使之失效，從而賦予細(xì)菌抗藥性。 最初在隨機(jī)過(guò)程中產(chǎn)生的微小差異 ，將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴(yán)重地失衡 。 ? 由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對(duì)抗生素的抗性 、產(chǎn)抗生素 、 降解復(fù)雜有機(jī)化合物 ， 以及產(chǎn)生大腸桿菌素 、 腸毒素及限制酶與修飾酶等等 。質(zhì)粒 DNA制備 一、質(zhì)粒簡(jiǎn)介 ? 質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀 DNA分子 ? 其大小范圍從 lkb至 200kb以上不等 。 ? 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)． 二、 質(zhì)粒特性 1. 分子相對(duì)小 ? 在 5kb左右，質(zhì)粒較小，比較穩(wěn)定，不易受物理因素的損傷，此外，較小的質(zhì)粒一般有較高的拷貝數(shù)。 ? 在一些細(xì)胞中 ， 一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢(shì) ， 而在另一些細(xì)胞中 ， 與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風(fēng) 。 ?
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