質(zhì)粒dna制備-免費閱讀
【正文】 ? 大多數(shù)情況下 ， 用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量制備物中的雜質(zhì) 。 如出現(xiàn)這種狀況 ， 在下次提取時 ， 可以適當縮短堿變性時間 ， 不必按某些書籍中規(guī)定的 10分鐘時間操作 ． ? ? 在煮沸法中 ， 過長時間 ， 過高熱度也會導致類似問題的出現(xiàn) ， 這種影響實驗結(jié)果的操作細節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株和質(zhì)粒情況加以適當改進 。 ? 若一定要用煮沸法提取這類菌株的質(zhì)粒DNA，不管是大量還是小量制備，必須用酚、氯仿反復抽提幾次．以去除該酶． 2．質(zhì)粒的大小 ? 大于 15kb的質(zhì)粒 DNA易被強烈的物理或化學作用損壞 ， 所以常選用操作過程較溫和的 SDS法 。 CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。 ? 長時間在氯霉素存在下 ， 質(zhì)粒 DNA合成過程中 ， 復制鏈中會摻入核糖核苷酸 ， 對堿性條件敏感 ， 將會導致大量的缺口環(huán)狀DNA和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生 ． ? 但有些人仍然偏愛用氯霉素選擇性擴增質(zhì)粒 ， 其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量 。 三、常用 質(zhì)粒載體 1. pBR322 ? pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長為 4 363bp，由 3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來自 pRSF2124， tetr來自 pSCl01，復制起始點來自 pM9。 ? 常用來作為標記的有氨芐青霉素抗性(ampicillin resistance， ampr)基因，此基因編碼 β — 內(nèi)酰胺酶，該酶能水解氨芐青霉素的 β — 內(nèi)酰胺環(huán)使之失效，從而賦予細菌抗藥性。 最初在隨機過程中產(chǎn)生的微小差異 ，將很快導致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴重地失衡 。 ? 由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性 、產(chǎn)抗生素 、 降解復雜有機化合物 ， 以及產(chǎn)生大腸桿菌素 、 腸毒素及限制酶與修飾酶等等 。質(zhì)粒 DNA制備 一、質(zhì)粒簡介 ? 質(zhì)粒是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復制的小環(huán)狀 DNA分子 ? 其大小范圍從 lkb至 200kb以上不等 。 ? 質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)． 二、 質(zhì)粒特性 1. 分子相對小 ? 在 5kb左右，質(zhì)粒較小，比較穩(wěn)定，不易受物理因素的損傷，此外，較小的質(zhì)粒一般有較高的拷貝數(shù)。 ? 在一些細胞中 ， 一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢 ， 而在另一些細胞中 ， 與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風 。 ?
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