體內(nèi)藥物分析方法及方法的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)-預(yù)覽頁
【正文】 能獲得的設(shè)備條件加以考慮 ， 選擇可行的方法 。 空白值高低或色譜圖狀況將影響到方法的靈敏度和專屬性 ， 應(yīng)力求將空白值降低 。 (四 )空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定 ? 于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品后按擬定方法進(jìn)行測(cè)定 ， 求得樣品回收率數(shù)據(jù) ， 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 因藥物在體內(nèi)變化是復(fù)雜的 ， 如不注意藥物代謝和蛋白結(jié)合情況 ， 則應(yīng)用體外建立的方法 ，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定時(shí)往往會(huì)失敗 ， 甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論 ， 所以在設(shè)計(jì)方法時(shí)強(qiáng)調(diào)對(duì)藥物體內(nèi)過程要有一定程度的了解 ， 從而選擇避免干擾和適合樣品實(shí)際情況的方法 。 ? 評(píng)價(jià)一個(gè)體內(nèi)藥物分析方法的優(yōu)劣主要有以下幾個(gè)指標(biāo)：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、專屬性或選擇性、可測(cè)濃度范圍、測(cè)定所需時(shí)間以及對(duì)生物樣品的適應(yīng)性等，現(xiàn)擇要討論如下： （ 一 ） 準(zhǔn)確度 ? 準(zhǔn)確度 (accuracy)是方法評(píng)價(jià)的最基本要點(diǎn)之一 ， 它是表示測(cè)定結(jié)果與真值的符合程度 。 對(duì)于一個(gè)方法來說 ， 更為重要的是每次測(cè)定所得回收率要保持恒定 ， 雖然有時(shí)回收率較低 ， 但只要重現(xiàn)性好 ， 通過校正后仍可采用 。 ? 例如取一定量被測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品 ， 加到空白血樣中 ， 按規(guī)定方法處理 ， 使最后溶液中藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 1ug/mL， 測(cè)定色譜峰面積 ， 記為 A測(cè) ， 另取 1ug/mL的藥物標(biāo)準(zhǔn)品的純?nèi)軇┤芤阂私舆M(jìn)樣 ， 測(cè)得色譜峰面積記為 A真 ， 用外標(biāo)法計(jì)算 。 另取相同濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純?nèi)軇┤芤哼M(jìn)樣 ， 得藥物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積 ， 計(jì)算兩者的比值 R真 ＝A39。 2． 方法回收率 ? 取一系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中 ，按設(shè)定方法測(cè)定 ， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及響應(yīng)的測(cè)定信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 先按最小二乘法求出回歸方程 。 ? 在測(cè)定回收率時(shí) ， 不管采用何種方法 ， 都要注意以下幾個(gè)問題： ① 添加的藥物量必須與實(shí)際測(cè)定量相近； ② 添加物質(zhì)必須與實(shí)際存在的狀態(tài)相似； ③ 必須同時(shí)做空白試驗(yàn) 。 用相關(guān)系數(shù) r來表示 ， 一般要求 r＞ ， 直線的斜率接近 1， 表明兩法吻合 。每個(gè)濃度平行測(cè)定 5～ 7次 ， 計(jì)算測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差 。 ? 日內(nèi) (或批內(nèi) )精密度是考察分析方法在短期內(nèi)測(cè)定方法的變異情況 ， 凡是在同一天內(nèi)將樣品多次測(cè)定所計(jì)算出的精密度稱為日內(nèi)精密度；凡在同一批內(nèi)樣品多次測(cè)定所計(jì)算出的精密度稱為批內(nèi)精密度 。 因此 ， 考察分析方法的精密度時(shí) ， 還應(yīng)考察日間或批間精密度 。 ? 通常以被測(cè)信號(hào)和背景噪音比 S/N為 2～ 3倍時(shí)的被測(cè)物的絕對(duì)量來表示 ， LOD＝ 3N/S（ N＝噪音 ， S＝被測(cè)物信號(hào) /單位重量 )。 2． 定量限 (limit of qnantification， LOQ) ? 定量限是指生物介質(zhì)中藥物可定量測(cè)定的最低量 ， 表示方式和測(cè)定方法與檢測(cè)限相同 ， 它與檢測(cè)限的不同在于定量限規(guī)定的最低測(cè)得濃度應(yīng)該符合一定精密度和準(zhǔn)確度的要求 。 3． 最低檢測(cè)濃度 ? 最低檢測(cè)濃度則多指可進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度 ， 它與樣品體積大小等因素有關(guān) ， 可通過下式求得 ， ? 以上表示靈敏度的方法均是指儀器的靈敏度 ，即進(jìn)入儀器的最低絕對(duì)量或最低濃度 。 這表明雖然儀器靈敏皮相同 ， 但因樣品預(yù)處理方法不同 ， 就有可能影響到實(shí)際樣品測(cè)定的靈敏度 。 ? 考察一個(gè)方法是否專屬 ， 應(yīng)著重考慮代謝物 、內(nèi)源性物質(zhì)和同時(shí)服用藥物的干擾 。 如果大于 10％ 的空白樣品顯示大的干擾 ， 應(yīng)另取一組空白樣品重試 ， 如果仍有 10％ 以上的空白樣品顯示大的干擾 ， 則應(yīng)改變擬定的方法 ， 以消除干擾 。 根據(jù)藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度和響應(yīng)的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 或計(jì)算回歸方程 ， 求出 r值和濃度范圍 。 要求 LOQ處偏離標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)小等于 20％ ， 其他各點(diǎn)應(yīng)小等于 15％ 。 1． 長期貯存穩(wěn)定性 ? 長期穩(wěn)定性的貯存時(shí)間應(yīng)超過收集第一個(gè)樣品至最后一個(gè)樣品分析所需的時(shí)間周期 。 3． 冷凍 解凍穩(wěn)定性 ? 取高 、 低濃度樣品至少各 3份 ， 于 20℃ 貯存24h， 取出臵室溫放臵使自然融解 。 應(yīng)用實(shí)例 ? 例 1：用 HPLC法測(cè)定生物樣品中淫羊藿苷的濃度 。 取混懸液 乙酸乙酯 ， 合并兩次提取液 ，于 50℃ 水浴用氮?dú)獯蹈?， 加入甲醇 mL， 振蕩溶解后進(jìn)樣 10 uL。 另用甲醇制成 1mg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液 ，再用甲醇稀釋成 40ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液 ， 臵冰箱保存 。 血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 (n＝ 6)為： ? 其他生物樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的 r值均大于。 ? (4)精密度 用空白血漿制成含 ICA 2， 8， 32，128 ug/mL樣品溶液各 5管 ， 測(cè)定日內(nèi)及日間誤差 ， 結(jié)果見表 41。為了獲得最佳分離效果 ， 首先用甲醇 :水為流動(dòng)相進(jìn)行分離 ， 當(dāng)比例為 55:45時(shí) ， 雖然 ICA與其他化學(xué)成分已分離 ， 但其保留時(shí)間較長 ， 峰形較寬 ， 且柱壓較高 。 阿斯匹林 、 非那西汀均在 ICA前 1～ 5min出峰 ， 卻被淫羊藿提取液中其他成分所干擾 。 ? (9)藥物在生物樣品中的穩(wěn)定性 于各空白樣品中加入 ICA標(biāo)準(zhǔn)品 ， 配制成 15ug/mL濃度的樣品數(shù)份 ， 臵 20℃ 冰箱保存 ， 分別于第 0、 1 30 d按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定 ， RSD均小于 ％ 。 ? 血藥濃度測(cè)定結(jié)果表明 ， 本文建立的分析方法可滿足 ICA藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要 ， 具有靈敏度高 、 準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn) 。 精密稱取依普黃酮代謝物 MI對(duì)照品 10 mg， 同法制成 25mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 ， 4 ℃ 避光保存 。 ? ② 標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)血漿 于 10mL具塞玻璃試管中 ， 加人提取緩沖液 800 uL和內(nèi)標(biāo)液 100uL， 搖勻后加提取液叔丁基甲醚 3mL， 于液體混合器內(nèi)混合液渦旋處提取1min， 離心 (3000r/min)10min， 吸取上層有機(jī)相臵 5mL尖底刻度試管中 ， 在 40℃ 水浴中通氮?dú)獯蹈?， 以 100uL流動(dòng)相富集 ， 進(jìn)樣 10～ 20 uL， 測(cè)定峰高 ， 依普黃酮與內(nèi)標(biāo)的峰高之比為橫坐標(biāo) ， 依普黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；同法繪制代謝物 MI標(biāo)準(zhǔn)曲線 。平均提取回收率見表 42。 標(biāo)準(zhǔn)血漿中依普黃酮及其代謝物 MI和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為 ． ， 無干擾蜂出
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