《基因轉(zhuǎn)染技術》ppt課件-預覽頁
【正文】 Heparan Sulfate Proteoglycanes 、 直接注射法 將含有 DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細胞攝入 DNA鏈進行表達，在肌細胞中，基因表達可持續(xù)數(shù)月 。 一般說來，在磷酸鈣轉(zhuǎn)染實驗中要使用高濃度的DNA(1～ 50ug/ml)。 制備程序比較簡單，可以通過多聚碳酸脂濾膜(polycarbonate filter)消毒滅菌，用它包裝的 DNA在 4℃ 下可長期保存不失活性，以及毒性低、包裝容量大、可保護 DNA免受核酸酶的降解作用等等 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移的最大優(yōu)勢在于能在活體內(nèi)應用。 、 電穿孔法 電穿孔通過將細胞暴露在短暫的 高場強電脈沖 中轉(zhuǎn)導分子。 電穿孔之前若用秋水仙酞胺 (colcemid)預處理細胞 10小時，可提高轉(zhuǎn)化效率 3～ 10倍。 美國 BioRad公司 PDS1000型 /He基因槍 、 DEAE葡聚糖和 polybrene聚陽 離子法 二乙氨乙基葡聚糖 (diethylaminoethyldextran) 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復合物和帶負電的 DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細胞表面。通過受精過程，將外源性基因?qū)胧芫?，大大簡化了轉(zhuǎn)基因動物的制備過程。目前常用的病毒載體有下列幾種。 、 DNA病毒載體 主要有 腺病毒相關病毒載體 ， 皰疹病毒載體 。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的 60%為宜，轉(zhuǎn)染當日，在轉(zhuǎn)染前 4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。 （二）靶基因質(zhì)粒 DNA的準備 、 具體的基因轉(zhuǎn)染條件應參考所使用的試劑和方法進行優(yōu)化。故必須首先將轉(zhuǎn)導細胞和未轉(zhuǎn)導的細胞加以區(qū)分。 、 外源基因是否真的轉(zhuǎn)入靶細胞必須用分子雜交方法進行證實。其中包括對目的基因和標記基因的鑒定。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 所有細胞 適用細胞廣，細胞致死率高，操作復雜 病毒介導法 通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 特定宿主細胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細胞；但攜帶基因不能太大；需考慮安全因素 磷酸鈣法 磷酸鈣 DNA復合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 所有細胞 適用細胞廣，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需 根據(jù)不同細胞類型 優(yōu)化實驗條件 顯微注射法或基因槍法 使用一根細針頭將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核；基因槍使用高壓 microprojectile將大分子導入細胞。 LOG
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