《基因轉(zhuǎn)染技術(shù)》ppt課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 Heparan Sulfate Proteoglycanes 、 直接注射法 將含有 DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細(xì)胞攝入 DNA鏈進(jìn)行表達(dá)，在肌細(xì)胞中，基因表達(dá)可持續(xù)數(shù)月 。 一般說來，在磷酸鈣轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中要使用高濃度的DNA(1～ 50ug/ml)。 制備程序比較簡(jiǎn)單，可以通過多聚碳酸脂濾膜(polycarbonate filter)消毒滅菌，用它包裝的 DNA在 4℃ 下可長(zhǎng)期保存不失活性，以及毒性低、包裝容量大、可保護(hù) DNA免受核酸酶的降解作用等等 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的最大優(yōu)勢(shì)在于能在活體內(nèi)應(yīng)用。 、 電穿孔法 電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的 高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖 中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。 電穿孔之前若用秋水仙酞胺 (colcemid)預(yù)處理細(xì)胞 10小時(shí)，可提高轉(zhuǎn)化效率 3～ 10倍。 美國(guó) BioRad公司 PDS1000型 /He基因槍 、 DEAE葡聚糖和 polybrene聚陽(yáng) 離子法 二乙氨乙基葡聚糖 (diethylaminoethyldextran) 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的 DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過受精過程，將外源性基因?qū)胧芫?，大大?jiǎn)化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備過程。目前常用的病毒載體有下列幾種。 、 DNA病毒載體 主要有 腺病毒相關(guān)病毒載體 ， 皰疹病毒載體 。如為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的 60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前 4小時(shí)換一將近新鮮培養(yǎng)液。 （二）靶基因質(zhì)粒 DNA的準(zhǔn)備 、 具體的基因轉(zhuǎn)染條件應(yīng)參考所使用的試劑和方法進(jìn)行優(yōu)化。故必須首先將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞加以區(qū)分。 、 外源基因是否真的轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞必須用分子雜交方法進(jìn)行證實(shí)。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因的鑒定。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 適用細(xì)胞廣，細(xì)胞致死率高，操作復(fù)雜 病毒介導(dǎo)法 通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；但攜帶基因不能太大；需考慮安全因素 磷酸鈣法 磷酸鈣 DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 適用細(xì)胞廣，但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需 根據(jù)不同細(xì)胞類型 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件 顯微注射法或基因槍法 使用一根細(xì)針頭將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核；基因槍使用高壓 microprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。 LOG
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