基因轉(zhuǎn)染技術(shù)ppt課件-免費閱讀
【正文】 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 所有細胞 適用細胞廣，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需 根據(jù)不同細胞類型 優(yōu)化實驗條件 顯微注射法或基因槍法 使用一根細針頭將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核；基因槍使用高壓 microprojectile將大分子導入細胞。其中包括對目的基因和標記基因的鑒定。故必須首先將轉(zhuǎn)導細胞和未轉(zhuǎn)導的細胞加以區(qū)分。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的 60%為宜，轉(zhuǎn)染當日，在轉(zhuǎn)染前 4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。目前常用的病毒載體有下列幾種。 美國 BioRad公司 PDS1000型 /He基因槍 、 DEAE葡聚糖和 polybrene聚陽 離子法 二乙氨乙基葡聚糖 (diethylaminoethyldextran) 帶正電的 DEAE葡聚糖或 polybrene多聚體復合物和帶負電的 DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細胞表面。 、 電穿孔法 電穿孔通過將細胞暴露在短暫的 高場強電脈沖 中轉(zhuǎn)導分子。 一般說來，在磷酸鈣轉(zhuǎn)染實驗中要使用高濃度的DNA(1～ 50ug/ml)。 ?基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達。 、 磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、 DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細胞膜并經(jīng)過細胞內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。 、 圖 1. 陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染 、 受體介導的基因轉(zhuǎn)移 依靠受體介導的細胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因。 電穿孔轉(zhuǎn)染效率主要取決于所用的細胞類型。 這項轉(zhuǎn)染方法是近年來才發(fā)展出來應(yīng)用在魚類轉(zhuǎn)殖的最新技術(shù)，它最大有點就是簡單方便。這一類是利用病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性成為腫瘤基因治療的有效方法。靶基因被導入細胞后，一般在轉(zhuǎn)染后 24小時，靶基因即在細胞內(nèi)表達。常用的方法有原位雜交、 Southern雜交。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細胞； 操作較簡便但 重復性差 細胞毒性較大；效率較低 DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 抑制核酸酶 內(nèi)吞作用 瞬時表達 操作相對簡單；但需高濃度DNA ； DEAE葡聚糖濃度 ；溫育時間 陽離子脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體和核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 適用細胞廣；轉(zhuǎn)染效率高，重復性好但轉(zhuǎn)染時需除血清和抗生素；相對具有一定毒性 陽離子聚合物 陽離子
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