《基因轉(zhuǎn)染技術(shù)》ppt課件(文件)
【正文】 基因載體中所含有的抗性標志選用相應(yīng)的藥物，最常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素（ hygromycin）和新霉素（ neomycin ） （三）轉(zhuǎn)染與分析 、 在目前的技術(shù)狀態(tài)下，基因轉(zhuǎn)染效率很難達到 100﹪ 。 （ 3） 基因共轉(zhuǎn)染技術(shù) 將目的基因表達載體 DNA和標記基因表達載體 DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細胞中，分別使用標記基因和目的基因?qū)?yīng)的選擇劑進行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)化子。 、 在篩選出轉(zhuǎn)化子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導細胞中外源基因的表達狀況。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 所有細胞 適用細胞廣，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需 根據(jù)不同細胞類型 優(yōu)化實驗條件 顯微注射法或基因槍法 使用一根細針頭將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核；基因槍使用高壓 microprojectile將大分子導入細胞。 5. 各種 轉(zhuǎn)染方法 比較 轉(zhuǎn)染方法 原理 應(yīng)用 特點 電穿孔法 細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中，將誘導沿細胞膜的電壓差異，這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 適用細胞廣；轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好但轉(zhuǎn)染時需除血清和抗生素；相對具有一定毒性 陽離子聚合物 陽離子聚合物與核酸等形成穩(wěn)定的復(fù)合物被細胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 為最新一代的轉(zhuǎn)染試劑，具有操作簡單；穩(wěn)定性好；轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低的特點；通過調(diào)節(jié)聚合物 /DNA比例優(yōu)化實驗。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 所有細胞 適用細胞廣，細胞致死率高，操作復(fù)雜 病毒介導法 通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 特定宿主細胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細胞；但攜帶基因不能太大；需考慮安全因素 磷酸鈣法 磷酸鈣 DNA復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細胞； 操作較簡便但 重復(fù)性差 細胞毒性較大；效率較低 DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 抑制核酸酶 內(nèi)吞作用 瞬時表達 操作相對簡單；但需高濃度DNA ； DEAE葡聚糖濃度 ；溫育時間 陽離子脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體和核酸帶負電的磷酸基團形成復(fù)合物被細胞內(nèi)吞。常用方法有原位雜交、 Northern雜交、免疫組織化學染色等，原位及Northern雜交是檢測外源基因轉(zhuǎn)錄出的 mRNA,后者則是檢測外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。常用的方法有原位雜交、 Southern雜交。這樣的新技術(shù)發(fā)展很快，常
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