【正文】 術(shù)術(shù) 的的 發(fā)發(fā) 展展 （一）材料范圍的逐步擴大 第第 二二 節(jié)節(jié) 組組 織織 培培 養(yǎng)養(yǎng) 原原 理理 與與 技技 術(shù)術(shù) ? 細胞是生物有機體的基本結(jié)構(gòu)單位，特別是植物細胞又是在生理上發(fā)育上具有潛在 7 全能性的單位。從一個分化的有專一功能的細胞，要表現(xiàn)它的全能性，首先要經(jīng)過去分化（脫分化）的過程，改變細胞原來的結(jié)構(gòu)、功能，而回復(fù)到無結(jié)構(gòu)的分生組織狀態(tài)，即愈傷組織狀態(tài)。 ? 有分化胚狀體能力的種子植物已有 117種（分屬于 34科， 75屬）。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。 培養(yǎng)室 培養(yǎng)室的功能是對離體材料進行控制培養(yǎng)。 攝影室及暗室 其功能是進行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。 2．培養(yǎng)基的 名稱－－多數(shù)以發(fā)表人的名字命名，再加上年號。 ? SH： 與 B5相似，無機鹽的含量稍高。 （ 2） 受酶和酸的作用易分解。 （ 2）遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。 二二 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 的的 制制 備備 （（ 一一 ）） 母母 液液 配配 制制 和和 保保 存存 （（ 二二 ）） 配配 制制 過過 程程 （（ 三三 ）） pH值值 的的 調(diào)調(diào) 節(jié)節(jié) （（ 四四 ）） 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 分分 注注 ：： 趁趁 熱熱 分分 注注 （（ 五五 ）） 滅滅 菌菌 和和 洗洗 滌滌 三三 生生 長長 調(diào)調(diào) 節(jié)節(jié) 物物 質(zhì)質(zhì) 的的 應(yīng)應(yīng) 用用 （（ 一一 ）） 生生 長長 素素 1．吲哚乙酸（ IAA）： 有天然，也可合成，活力低。 不不 同同 器器 官官 對對 生生 長長 素素 的的 反反 應(yīng)應(yīng) 根：對生長素最敏感，低濃度下 10－ 5～ 10－ 3PPM， 可促進生長；濃度高時，抑制生長。 （（ 二二 ）） 赤赤 霉霉 素素 （（ GA3）） 1． GA3對整個植株的作用比離體器官或組織作用顯著，這與生長素不同。 2. 可解除頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽生長。 IAA、 NAA、 IBA、 2,4D、 GA3可先用少量 95%酒精溶解，再加水； KT、 BA等則可用 ～ 1 N的 HCl溶解，再加水。 ? 2． 生長素和細胞分裂素的比例決定著發(fā)育的細胞類型，愈傷組織再分化是長根或長芽。 hardened off 二二 外外 植植 體體 滅滅 菌菌 1. 過程 2. 材料與前處理 3. 滅菌強度 藥劑種類與消毒處理時間 三三 、 組組 織織 培培 養(yǎng)養(yǎng) 過過 程程 中中 的的 變變 異異 現(xiàn)現(xiàn) 象象 （一） 現(xiàn)象 Somaclonal Variation: variability in plants regenerated from tissue culture that is either induced or uncovered by a tissue culture process. Most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined, positive changes can usually be recovered. ? The source for most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cultivar, a landrace, a plant accession, a wild related species, or in an unrelated anism 11 ? Total sources of variation: – Mutation, Hybridization, Polyploidy ? Somaclonal variation is a general phenomenon of all plant regeneration systems that involve a callus phase ? There are two general types of Somaclonal Variation: – Heritable, geic changes (alter the DNA) – Stable, but nonheritable changes (alter gene expression, AKA epigeic) ? Since utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to consider mutation breeding in more detail → Inducing Mutations ? Physical Mutagens (irradiation) – Neutrons, Alpha rays ? Densely ionizing (“Cannon balls”), mostly chromosome aberrations – Gamma, Beta, Xrays ? Sparsely ionizing (“Bullets”), chromosome aberrations amp。胚乳培養(yǎng)研究主要集中探討以下問題 ： 胚乳細胞全能性：在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細胞是否與其它體細胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。蘋果、柚、甜橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等胚乳培養(yǎng)再生了植株。過濾后的花粉液再經(jīng)低速離心（ 100～ 160r/min） 3min， 將沉淀用新鮮培養(yǎng)期稀釋，重復(fù)兩 次，可得到較純凈的花粉群體。 作業(yè)布置； ? 概念： 組織培養(yǎng)、體細 胞無性系變異、外植體、愈傷組織、胚狀體、細胞全能性、離體保存等 ? 簡答題： ? 簡述組織培養(yǎng)室的基本設(shè)施； ? 簡述培養(yǎng)基配制的基本流程、應(yīng)注意哪些方面？ ? 簡述組織培養(yǎng)技術(shù)主要有哪些應(yīng)用？ 課后自我總結(jié)分析 該章是本課程的重點，是同學(xué)們畢業(yè)后可以應(yīng)用的最基礎(chǔ)技術(shù)；除技術(shù)外，同學(xué)們對基本建立起一個組培實驗室也很有興趣。 重 點 難 點 原生質(zhì)體分離培養(yǎng)步驟、主要應(yīng)用；原生質(zhì)體培養(yǎng)方法。 146 genera. Tendency: model plants to staple amp。 ? 材料預(yù)處理 – 在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可提高原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。 ? 酶 處理 ? 原 生質(zhì)體收集和純化 – 過濾 400200目 (40100μ） – 界面離心法： 13%甘露醇 /25%蔗糖 – 飄浮 法：常用的飄浮劑有蔗糖、 Percoll、 Ficoll。 ? 伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴重損壞使，細胞才能被染色，因而可以通過細胞被染色與否確定活性。 3. 激素 ? 常用的激素： NAA、 IAA、 BA與 2,4D 4. 滲透壓 ? 常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。也可用高滲溶液產(chǎn)生質(zhì)壁分離的方法、電子顯微鏡觀察技術(shù)和冰凍蝕刻法等進行再生細胞壁的研究。 原生質(zhì)體 一般 培養(yǎng) 2～ 7 d后開始第 1次分裂，但開始第 1次分裂的時間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。待小愈傷組織長至 1 mm左右時應(yīng)及時轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進一步生長。 ? 原生質(zhì)體再生植株變異還與植物種類有關(guān) (二二 )植植 株株 表表 型型 變變 異異 ? 原生質(zhì)體再生植株表型變異包括植物學(xué)性狀、同功酶譜、抗性變異 ? 變異程度的大小與起始材料及培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異有關(guān)。 electrofusion Numerous reports, some were not realistic 4) Early 1980s, model plants to staple/economic crops, symmetric to asymmetric, more realistic 5) Late 1980s, many reports on perennial woody plants 6) 1990s to date, a conventional amp。 number ? Cytology：： Chromosome numbers, flow cytometry, FISH/GISH ? Isozyme ? Molecular markers: RAPD, RFLP, RAPD, SSR etc. 體細胞雜交技術(shù)的應(yīng)用 ? To circumvent biological barriers to create novel germplasm (克服生殖障礙，創(chuàng)造新種質(zhì) ) ? To transfer beneficial traits to improve crop quality (轉(zhuǎn)移有益性狀，改良作物品質(zhì) ) ? To transfer partial chromosomes to produce asymmetric hybrids (轉(zhuǎn)移部分染色體，創(chuàng)造非對稱雜種 ) ? To transfer cytoplasmic genome to create cybrids (轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組，創(chuàng)造胞 20 質(zhì)雜種 ) ? To serve as bridge material for further improvement amp。 ? 植物生物技術(shù)導(dǎo)論 (許亦農(nóng) 麻密 譯 ) 化學(xué)工業(yè)出版社 ? 肖尊安 植物生物技術(shù) 化學(xué) 工業(yè)出版社 教學(xué)目 的 和要求 了解園藝生產(chǎn)中存在的病毒病類型與檢測方法 了解病毒脫除的原理與技術(shù)方法 重 點 難 點 病毒病脫除技術(shù)； 病毒病的類型與分子檢測方法 教學(xué)進程 （含 教學(xué)內(nèi)容、 教學(xué)方法、 輔助手段、 師生互動、 學(xué)時分配、 板書設(shè)計） 第第 一一 節(jié)節(jié) 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 一一 病病 毒毒 的的 定定 義義 ? 病毒的定義：是一類沒有細胞核、細胞質(zhì)和細胞壁結(jié)構(gòu)，但有遺傳復(fù)制等生命特征，主要由核酸和蛋白質(zhì)組成的大分子生物。 二二 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 的的 發(fā)發(fā) 生生 及及 危危 害害 特特 點點 （（ 一一 ）） 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 的的 侵侵 染染 特特 性性 ? 與真菌和細菌病害不同，病毒多為 系統(tǒng)性侵染 （ systemic infection）， 即病毒侵染后很快擴展至植物的全身，因此，從帶有病毒的植株上取接穗或插條繁育的苗木，也帶有病毒。這類病原引起的病害發(fā)病規(guī)律相似，均可通過嫁接傳染，許多還可經(jīng)由介體 昆蟲傳播，在防治策略上也有相同之處。有些鑒別寄主對病毒的侵染易產(chǎn)生枯斑，因此將產(chǎn)生枯斑的寄主也稱為枯斑寄主。 ? 接種方法 汁液 摩擦法，從待檢植株上取一定的組織，包括葉片、花瓣、根、或枝皮，加入 2~5倍（ V/W） 的提取緩沖液，在低溫條件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金剛砂的供試指示植物葉片上輕輕摩擦，接種完畢立即用蒸餾水沖洗凈葉片上殘留的汁液。 ? 兼具這兩種特性的抗原物質(zhì)稱為 完全抗原 ；只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性的抗原物質(zhì)稱為 半抗原 。常用動物為家兔，一般選用半周歲左右、體重 2－ 3千克、健康、自然抗體陰性的日本大耳兔和半耳垂家兔 .以上方法制備的抗血清含有多種抗體，這些抗體是由動物的多種淋巴細胞所產(chǎn)生的，因此也稱為多克隆抗體（ Polyclonal antibody， Pab） (2) 單克隆抗體 單克?。?Monoclone） 即是單一的無性細胞系，或稱單細胞系。 抗原吸附→免疫修飾→染色→透射電鏡觀察 (2) 酶聯(lián)免疫吸附分析（ Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA） 酶酶 聯(lián)聯(lián) 免免 疫疫 吸吸 附附 分分 析析 （（ Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）） ? 具有檢測靈敏度高 、 快速、簡便、準確等優(yōu)點，不需要 提純病毒，可在較短時間內(nèi)檢測大量樣品。 (3)直直 接接 組組 織織 免免 疫疫 雜雜 交交 分分 析析 （（ Direct tissue blot immunoassay， DTBIA）） ? 也稱組織免疫印跡 ELISA（ Tissue printing ELISA） 分析，是 ELISA的另一形式，其原理與 ELISA相似，所不同的是用一種特殊的薄膜代 替常規(guī)的微量板作固相支持物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的是不可溶的有色物質(zhì)沉積在帶病毒的部位，觀察有色物質(zhì)即可判斷是否帶有病毒。 ? PCR技術(shù) 病毒和類病毒的基因組成已經(jīng)明確，可以根據(jù)已知序列設(shè)計特異引物進行PCR檢測 ? 核酸雜交技術(shù) 探針 第第 三三 節(jié)節(jié) 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 脫脫 除除 技技 術(shù)術(shù) 一一