【正文】 平板上菌落呈金黃色，周圍有溶血圈，在BairdParker平板上菌落呈灰黑色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。7 思考題（1）金黃色葡萄球菌引起食物中毒的機(jī)理是什么？（2）為什么采用血漿凝固酶試驗(yàn)來決定葡萄球菌致病和不致病?實(shí)驗(yàn)4 食品中溶血性鏈球菌的檢測(cè)1 目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法。因此，在羊血瓊脂平板上接種鏈球菌處，可以見到蘑菇狀或箭頭樣的溶血區(qū)。１℃檢樣25g（ml）＋225ml滅菌生理鹽水葡萄糖肉侵液肉湯或匹克氏肉湯血平板36177。1℃培養(yǎng)24h后接種血平板，置36177。溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長(zhǎng)時(shí)，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀。1℃%(如氯化鈣已潮解，%～%)，振蕩搖勻，置于36177。草酸鉀人血漿配制：，再加入5mL人血混勻，經(jīng)離心沉淀吸取上清液即為草酸鉀人血漿。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）溶血性鏈球菌涂片染色鏡檢為革蘭氏陽性，～1微米，鏈狀排列，鏈的長(zhǎng)短不一，短者由4～8個(gè)菌體組成，長(zhǎng)者達(dá)20～30個(gè)菌。在顯微鏡低倍鏡下觀察，菌落周圍一般不能見到紅血球。7 思考題（1）溶血性鏈球菌在血平板上生長(zhǎng)時(shí)的菌落特征？（2）溶血性鏈球菌的致病力強(qiáng)弱與那些生物特性有關(guān)？實(shí)驗(yàn)5 食品中沙門氏菌屬的檢驗(yàn)1目的要求（1）學(xué)習(xí)食品中沙門氏菌屬的檢驗(yàn)方法和基本原理。食品中沙門氏菌的含量較少，且常由于食品加工過程使其受到損傷而處于瀕死的狀態(tài)。大腸桿菌由于發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而出現(xiàn)與沙門氏菌形態(tài)特征不同的菌落，如在SS瓊脂平板上使中性紅指示劑變紅，菌落呈紅色，借此可把沙門氏菌同大腸桿菌相區(qū)別。3．2 培養(yǎng)基和試劑 緩沖蛋白胨水(BP)，氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液，四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，亞硫酸鉍瓊脂(BS)，DHL瓊脂，HE瓊脂，SS瓊脂，三鐵糖瓊脂(TSI)，蛋白胨水，靛基質(zhì)試劑，KCN培養(yǎng)基，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，糖發(fā)酵管，ONPG培養(yǎng)基，半固體瓊脂，緩沖葡萄糖蛋白胨水(附MR、V于36177。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。于36177。１℃18～24h40～48h36177。１℃檢 樣前增菌法：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25g＋BP 225ml直接增菌法：鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品25g＋滅菌生理鹽水225ml，做成檢液勻液10ml＋MM(或TTB)100ml10ml+SC100ml。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同，乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時(shí)與大腸埃希氏菌不能區(qū)別。因此需要做幾項(xiàng)最低限度的實(shí)驗(yàn)。表323 腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)H2S靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸脫羧酶判定菌屬A1＋－－－＋沙門氏菌屬A2＋＋－－＋沙門氏菌屬（少見）、愛德華氏菌屬A3＋－＋＋－枸櫞酸桿菌屬、奇異變形桿菌A4＋＋＋＋－普通變形桿菌B1－－－－－－－－＋－沙門氏菌屬、埃希氏菌屬甲型副傷寒沙門氏菌、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬B2－－＋＋－－－－＋－埃希氏菌屬埃希氏菌屬、志賀氏菌屬B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、枸櫞酸桿菌屬B4－＋＋/－＋－摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬注：（1）三糖鐵瓊脂底層均應(yīng)產(chǎn)酸，不產(chǎn)酸者可排除。（1）反應(yīng)序號(hào)A1典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。表323 附2甘露醇山梨醇判 定 結(jié) 果＋＋沙門氏菌屬靛基質(zhì)陽性變種（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）－－緩慢愛德華氏菌（3）反應(yīng)序號(hào)B1三糖鐵斜面產(chǎn)酸的菌株可首先排除，不產(chǎn)酸者可先做血清學(xué)鑒定，當(dāng)A—F多價(jià)血清不凝集時(shí)，補(bǔ)做鳥氨酸、ONPG、水楊苷、棉子糖和半固體動(dòng)力試驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)表32—3附3判定結(jié)果。表324 沙門氏菌屬亞屬的鑒定項(xiàng)目亞 屬ⅠⅡⅢⅣⅤ乳糖－－＋/（＋）－－ONPG－－＋－＋衛(wèi)矛醇＋＋－－＋丙二酸鈉－＋＋－－KCN－－－＋＋水楊苷－－－＋－（＋）遲緩陽性4．6血清學(xué)分型鑒定（1）抗原的準(zhǔn)備％瓊脂斜面培養(yǎng)物作玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。每種多價(jià)O血清所包括的O因子如下：OA l，2，3，4，5，9，10，12，19，2l，26,46OB 6，7，8，11，13，14,20，22，23，24OC 16，17，18，28，30，35，38OD 39，40，41，42，43，44，45OE 47，48，50，51，52OF 53，54，55，56，57，58，59OG 60，61，62，63，65,66，67（3）H抗原的鑒定屬于A—F各O群的常見菌型，依次用下述(表32一5)H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。如仍只檢出一個(gè)相應(yīng)的抗原，要用位相變異的方法檢驗(yàn)其另一個(gè)相。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合以上生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照考夫曼——懷特沙門氏菌屬抗原表解和補(bǔ)充表解判定菌型，并報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。它們主要通過食品加工、集體食堂和飲食行業(yè)的從業(yè)人員中痢疾患者或帶菌者污染食物，從而導(dǎo)致痢疾的發(fā)生，是一種較常見的、危害較大的致病菌。3．3 培養(yǎng)基和試劑GN增菌液、HE瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、三糖鐵瓊脂、半固體瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、苯丙氨酸瓊脂、西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂、葡萄糖銨瓊脂、糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、緩沖葡萄糖蛋白胨水、VP試劑、甲基紅試劑、氧化酶試劑、革蘭氏染液、志賀氏菌屬診斷血清等。１℃，6－8h36177。4．4 生化試驗(yàn)（1）志賀氏菌屬生化特性試驗(yàn)挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和半固體瓊脂各一管。結(jié)果見表331。如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別試驗(yàn)，確定菌型。表332 福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原型和亞型型抗原群抗原1aⅠ9……1bⅠ9……2aⅡ4……2bⅡ9……3aⅢ9……3bⅢ（9）……3cⅢ6……4aⅣ（3）…4bⅣ6……5aⅤ4……5bⅤ9……6Ⅵ（4）……x9……y4……注：……均為省略號(hào)表333 福氏志賀氏菌的血清學(xué)鑒定群6可能的型和亞型+2a、1a、4a、y變種+＋1b、3b、4b＋+3a+2b、x變種66 實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合以上生化和血清學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果，判定菌型并作出報(bào)告。當(dāng)人體攝入的蠟樣芽孢桿菌數(shù)目達(dá)到一定數(shù)量后就會(huì)引起食物中毒。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟4．1蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)程序（如圖341）36177。接種在選擇培養(yǎng)基(甘露醇卵黃多粘菌素瓊指)平板上，用L形棒涂布于整個(gè)表面，置37℃培養(yǎng)12～20h后，選取菌落數(shù)在30個(gè)左右者進(jìn)行計(jì)數(shù)。4．3 分離培養(yǎng)將檢樣或其稀釋液劃線于上述選擇性培養(yǎng)基平板上，置370C培養(yǎng)12～20h，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的菌落接種于肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)，然后做證實(shí)試驗(yàn)。（3）生化特性：本菌有動(dòng)力，產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，溶血，不發(fā)酵甘露醇和木糖，能液化明膠和還原硝酸鹽，在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。“－”90～100%菌株陰性，“＋/－”大多菌株陽性，“－/＋”大多菌株陰性。6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)作出檢驗(yàn)報(bào)告。人們由于食入污染本菌而未充分加熱的海產(chǎn)品或食物可引起食物中毒或胃腸炎。3．3 培養(yǎng)基及試劑 氯化鈉結(jié)晶紫增菌液、TCBS培養(yǎng)基、%氯化鈉三糖鐵瓊脂、生化試劑等。4．5初步鑒別用接種針挑取可疑菌落，%氯化鈉三糖鐵斜面，37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌對(duì)葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，甲基紅陽性，VP陰性，賴氨酸陽性，精氨酸陰性，鳥氨酸多數(shù)為陽性少數(shù)呈陰性，溶血性多數(shù)陽性，有少數(shù)不溶血，5 結(jié)果報(bào)告根據(jù)鏡檢的菌體形態(tài)特征、TCBS平板上菌落特征、生化試驗(yàn)等判斷樣品中是否含有副溶血性弧菌。（2）了解食品中空腸彎曲桿菌的檢驗(yàn)原理?？漳c彎曲桿菌為革蘭氏染色陰性菌，螺旋形，彎曲桿狀，大小為(～)μm(～5)μm，有一個(gè)以上螺旋并可長(zhǎng)達(dá)8μm，也可出現(xiàn)S形或似飛翔的海鷗形，菌體一端或二端有單根鞭毛，長(zhǎng)度約為菌體的2～3倍，有活潑的動(dòng)力或不產(chǎn)生動(dòng)力，超過48h的培養(yǎng)物以衰老的球菌狀居多。在布氏肉湯中生長(zhǎng)呈均勻混濁。3．3培養(yǎng)基 布氏肉湯、改良CampBAP培養(yǎng)基、血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、甘氨酸培養(yǎng)基。(2) 凈膛全禽和分割肉在一個(gè)滅菌容器中，用250mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯振搖洗滌樣品5min，肉湯經(jīng)滅菌紗布過濾，于23000r/min、4℃離心20min，或于16300r/min、4℃離心30min，棄去上清液，將沉淀物置于250mL三角瓶中，加入100mL布氏增菌肉湯，搖勻。（4）河水或污水取水樣2～4L，每升水樣加入5mL1mol/L硫代硫酸鈉，立即將濾膜置于100mL布氏增菌肉湯中，于微氧條件下，30℃預(yù)增菌3h后，再于37℃增菌2h，然后于42℃培養(yǎng)20～44h。檢查平板上有無不溶血、灰色、扁平、濕潤(rùn)、有光澤及有時(shí)沿接種線向外擴(kuò)散的菌落。培養(yǎng)方法同上，根據(jù)生化、生長(zhǎng)特性和抗生素敏感性試驗(yàn)進(jìn)行菌株證實(shí)。該培養(yǎng)基分裝于試管中，每管7mL。每日檢查有無生長(zhǎng)。(3) 氧化酶試驗(yàn)使用瓊脂平板表面經(jīng)24h培養(yǎng)的生長(zhǎng)物。(5) 1%甘氨酸中生長(zhǎng)試驗(yàn)將供試培養(yǎng)物接種于加有NR和1%甘氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置空氣中于37℃培養(yǎng)，每日檢查有無生長(zhǎng)，對(duì)未生長(zhǎng)者需培養(yǎng)5d，方可作出最后判斷。（8）TSI試驗(yàn)接種于TSI斜面，于微需氧條件35～37℃培養(yǎng)5d。將瓊脂平板上培養(yǎng)過夜的生長(zhǎng)物接種于1%馬尿酸溶液中，振搖后置37℃水浴中放置2h。于微需氧條件37℃培養(yǎng)24h，檢查有無抑菌圈。5 結(jié)果與報(bào)告根據(jù)生化鑒定結(jié)果表對(duì)食品中是否含有空腸彎曲菌作出鑒定并報(bào)告。（2）熟悉肉毒梭狀芽孢桿菌及其毒素檢驗(yàn)的原理和方法。肉毒梭狀芽孢桿菌屬于專性厭氧的革蘭氏陽性粗大桿菌，形成近端位的卵圓形芽孢，芽孢比繁殖體寬，使細(xì)菌呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀，在厭氧條件下產(chǎn)生劇烈的外毒素——肉毒毒素。在血平板上，出現(xiàn)與菌落幾乎等大或者較大的溶血環(huán)。這些毒素能引起人和動(dòng)物的肉毒中毒，根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（2）、D、E、F、G等七個(gè)型。各個(gè)型的肉毒梭菌分別產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，所以，肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等七個(gè)型。肉毒梭菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的最適溫度是25~30℃，而在人的體溫條件下細(xì)菌表現(xiàn)為絲狀，幾乎不能產(chǎn)毒、芽孢也不會(huì)發(fā)芽。3．4 其他 離心機(jī)、均質(zhì)器、厭氧培養(yǎng)裝置、小白鼠等。肉毒毒素檢測(cè)以小白鼠腹腔注射法為標(biāo)準(zhǔn)方法。如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時(shí)，則可將注射液做適當(dāng)稀釋，重新試驗(yàn)。檢樣（食品）毒素檢測(cè)增菌、產(chǎn)毒培養(yǎng)（30℃，5d）報(bào)告觀察生長(zhǎng)形狀，染色毒素報(bào)告分離培養(yǎng)觀察菌落性狀，染色鏡檢增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)30℃，5d毒素培養(yǎng)報(bào)告圖371 肉毒梭狀芽孢桿菌及毒素的檢驗(yàn)程序（3）毒力測(cè)定取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5 000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2只，每只0．5mL，觀察4d。同時(shí)以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對(duì)照。肉毒中毒的診斷必須以檢出食物中的肉毒毒素為準(zhǔn)。培養(yǎng)到期，若有生長(zhǎng)，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測(cè)試驗(yàn)，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。毒素檢測(cè)：培養(yǎng)特征檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成2份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48h，觀察生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)。24小時(shí)后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現(xiàn)。7 思考題（1）在食品中檢出肉毒梭狀芽孢桿菌，能否說明食物可引起食物中毒？（2）在食品中檢測(cè)肉毒梭狀芽孢桿菌及其毒素的過程中，應(yīng)注意那些事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)11 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗(yàn)1 目的要求（1）了解單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌?！　≡摼鸂I(yíng)養(yǎng)要求不高，在20～25℃培養(yǎng)有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng)2～5d可見倒立傘狀生長(zhǎng)，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動(dòng)。%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)瓊脂上，用450角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。3．3培養(yǎng)基 EB增菌液、TSAYE培養(yǎng)基、MMA培養(yǎng)基、硫酸鐵銨半固體（SIM）。李斯特氏菌在MMA平板上呈有光澤的蘭色或灰色的小的圓形菌落。挑取5個(gè)典型菌落的原因是一個(gè)樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃，24h25℃ 2～