【正文】 相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的染色方法，在實(shí)際工作中，應(yīng)用最廣泛的是革蘭染色法。 而革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層較薄，含脂質(zhì)多，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘復(fù)合物易被溶出而脫色。（3）固定：干燥后的標(biāo)本片在酒精燈火焰上來(lái)回通過(guò)3次（以鐘擺的速度），冷卻后染色。如果涂片太厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽(yáng)性菌染成紅色。（5）因細(xì)菌的菌齡不同染色結(jié)果也有差異，一般以18~24h培養(yǎng)物染色結(jié)果最好。（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定標(biāo)本15min，水洗。培養(yǎng)基應(yīng)為營(yíng)養(yǎng)較好的瓊脂平板（如血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂），不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS、中國(guó)藍(lán)、MAC等）。（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。結(jié)果：鞭毛染成紅色。2）脫色：用95%乙醇脫色1～2min，水洗。2）滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止。2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，微火加熱染色1min，水洗。5．異染顆粒染色細(xì)菌經(jīng)涂片、干燥、固定，加甲液（見(jiàn)附錄二）染色3~5min，水洗后加乙液染色1min，水洗，待干、鏡檢。1．壓滴法用接種環(huán)分別取菌液2～3環(huán)，置于潔凈載玻片中央。取一環(huán)菌液于蓋玻片中央，將凹玻片凹窩對(duì)準(zhǔn)蓋玻片上的菌液，迅速翻轉(zhuǎn)載玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片，使之與凹玻片粘緊封閉（見(jiàn)圖21），置顯微鏡下觀察?！窘Y(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)三 滅菌前的準(zhǔn)備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備【目的和要求】1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準(zhǔn)備。2．器材：試管、吸管、平皿、錐形瓶、量筒、吸管、精密PH試紙、天平、濾紙等。（2）用過(guò)的玻璃器材：1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應(yīng)先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌，然后趁熱倒出培養(yǎng)基，用5％肥皂水刷洗，再用自來(lái)水沖凈后倒置架上，晾干備用。5）注射器：用后若無(wú)病原微生物污染，立即用自來(lái)水將注射器及針頭等抽洗干凈；若有病原微生物污染，則立即進(jìn)行煮沸消毒（含有芽胞菌，則應(yīng)用高壓蒸汽滅菌）。2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于棉塞外。（2）滅菌上述玻璃器材可用高壓蒸汽滅菌法，也可用干烤法進(jìn)行滅菌。二、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序和方法培養(yǎng)基是用人工方法將細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按一定比例配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。1．培養(yǎng)基配制的基本程序包括：調(diào)配、溶化、矯正pH、過(guò)濾澄清、分裝、滅菌、鑒定等幾個(gè)主要步驟。其中PH試紙矯正法操作簡(jiǎn)便，快速，但誤差較大；用PH比色計(jì)和比色法測(cè)定PH較為準(zhǔn)確，后者無(wú)需特殊儀器。4 2 3 1 目測(cè)方向圖31 比色法若測(cè)定管偏酸或偏堿，、直到測(cè)定管的顏色與標(biāo)準(zhǔn)管相同為止，注意：在加酸或加堿矯正時(shí)要緩慢，并準(zhǔn)確記錄加入的量，按下式計(jì)算培養(yǎng)基中需加入的量。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過(guò)濾。2）瓊脂斜面：分裝于試管，分裝量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱放置成斜面，斜面長(zhǎng)度占試管長(zhǎng)度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。5）過(guò)濾除菌：用于血清、細(xì)胞培養(yǎng)液的滅菌。2．常用培養(yǎng)基的配制和用途（見(jiàn)附錄一）3．培養(yǎng)基配制的注意事項(xiàng)（1）在進(jìn)行調(diào)配時(shí)應(yīng)在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分粘附在瓶壁上。（3）滅菌后的培養(yǎng)基在進(jìn)行分裝時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作，傾注平板時(shí)培養(yǎng)基的溫度不能過(guò)高，否則冷凝水多，影響細(xì)菌的分離并易造成污染；也不能溫度過(guò)低，否則瓊脂過(guò)早凝固，使平板表面高低不平。3．熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察方法。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌的接種工具1．接種環(huán)和接種針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見(jiàn)圖41）。圖41 接種環(huán)和接種針 接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內(nèi)壓緊。主要用于液體標(biāo)本涂布接種。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細(xì)菌均勻分布于培養(yǎng)基中。方法：（圖43）（1）先將接種針在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。方法：（1）連續(xù)劃線法（圖44）1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）內(nèi)作來(lái)回劃線，再在4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每劃完一區(qū)是否需要燒灼接種環(huán)依標(biāo)本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持一定距離，線條要密而不重復(fù)。（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無(wú)菌操作挑取少許菌落。圖46 斜面培養(yǎng)基接種法5．涂布接種法本法主要用于活菌計(jì)數(shù)和藥敏試驗(yàn)。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干，然后用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同濃度的藥物，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計(jì)數(shù)菌落形成單位（colony forming unit，CFU），按下式算出每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)：1ml標(biāo)本中的活菌數(shù)=全平板CFU稀釋倍數(shù)7．細(xì)菌接種的注意事項(xiàng)（1）細(xì)菌接種過(guò)程中需注意無(wú)菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴(yán)格按要求進(jìn)行。（4）取菌時(shí)注意菌落不要取得太多，應(yīng)蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離出單個(gè)菌落。（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標(biāo)記再放置溫箱孵育。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上蓋下）置35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1824h。將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點(diǎn)燃的蠟燭，加蓋密封。3．微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內(nèi)的空氣排盡，再注入5%O10%CO85%N2的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結(jié)果。1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑鈀粒和指示劑美藍(lán)。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內(nèi)，密封罐蓋，使氣體釋放到罐中。（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接種到2個(gè)大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需氧菌生長(zhǎng)過(guò)程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開(kāi)始生長(zhǎng)。（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國(guó)際上公認(rèn)的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。觀察要點(diǎn)：注意觀察培養(yǎng)基的透明度、管底和液面上是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。3．固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象：菌落：由一個(gè)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖而形成的一個(gè)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)。菌落性狀的描述：大小、形狀、顏色、凸扁、表面光滑度、濕潤(rùn)度、光澤、透明度、邊緣、粘度、溶血（血平板）、氣味等?！驹噭┡c器材】1．菌種：大腸埃希菌、傷寒沙門(mén)菌、產(chǎn)氣腸桿菌?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】不同細(xì)菌具有不同的酶，對(duì)同一種基質(zhì)（糖、蛋白質(zhì)等）分解代謝的能力不同而可得到不同的代謝產(chǎn)物，檢查這些代謝產(chǎn)物就可幫助鑒別細(xì)菌，這類試驗(yàn)稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基中的pH下降因而指示劑顯紅色，產(chǎn)氣，則半固體中有氣泡出現(xiàn)；而傷寒沙門(mén)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基雖變紅但其中無(wú)氣泡。 （3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)基變紅者為細(xì)菌產(chǎn)酸，半固體中有氣泡即產(chǎn)氣。4）~。（2）方法：1）用接種環(huán)挑取大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中，置35℃培養(yǎng)箱，經(jīng)18~24h培養(yǎng)。故在培養(yǎng)基中加入含胍基的化合物（如肌酸或肌酐等），可加速該反應(yīng)。臨床應(yīng)用：主要用于產(chǎn)氣腸桿菌和大腸埃希菌的鑒別，產(chǎn)氣腸桿菌VP試驗(yàn)陽(yáng)性，后者為陰性。（3）結(jié)果觀察：液面的試劑變紅色為試驗(yàn)陽(yáng)性，黃色為陰性。（2）方法：將待測(cè)細(xì)菌穿刺接種于含硫酸亞鐵（或醋酸鉛）的半固體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24~48小時(shí)后觀察結(jié)果。最終有碳酸鈉和氨（NH3）產(chǎn)生，使培養(yǎng)基變堿，使其中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由淡綠色變成深藍(lán)色。臨床應(yīng)用：主要用于腸道桿菌的鑒別，產(chǎn)氣腸桿菌、沙門(mén)菌屬、克雷伯菌屬為陽(yáng)性，大腸埃希菌屬、志賀菌屬、愛(ài)德華菌屬為陰性。 （3）結(jié)果觀察：于30秒內(nèi)有大量氣泡出現(xiàn)者為試驗(yàn)陽(yáng)性，無(wú)氣泡者為陰性。在有分子氧存在的情況下，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使試劑對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物（靛酚藍(lán)）。（3）結(jié)果觀察：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色者為陽(yáng)性?！窘Y(jié)果記錄和報(bào)告】實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌的分布及消毒滅菌【目的和要求】，幫助建立無(wú)菌觀念。【試劑與器材】1．培養(yǎng)基：普通平板（或血平板）、肉湯培養(yǎng)基?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌分布檢測(cè)1．空氣細(xì)菌檢查（1）方法：取普通平板（或血平板）1個(gè)，選室內(nèi)或室外的一處空間，在離地面1m左右高度的桌面（或臺(tái)面）上，打開(kāi)平板蓋，讓培養(yǎng)基暴露于空氣中，10min之后，迅速蓋好蓋子，在底部寫(xiě)上標(biāo)記，放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。3）趁熱（不燙手為宜），傾注約15ml的普通瓊脂，立即在臺(tái)面上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混勻。2）倒入的培養(yǎng)基溫度大約在45℃左右（熱而不燙手為宜），太熱，太冷都不行。（2）結(jié)果觀察：拿出平板，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，并紀(jì)錄結(jié)果。（3）將培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。（3）將各管置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。物品放置在箱內(nèi)的金屬架上，既可以滅菌也可以干烤。（4）應(yīng)用：金屬器械、玻璃器皿、石膏等不易燃燒的物品。工作原理：在一密閉的容器內(nèi)對(duì)水加熱，產(chǎn)生熱蒸汽，蒸汽的增多使滅菌器內(nèi)的壓力增高，壓力增高繼而又使水的溫度增高。然后蓋嚴(yán)鍋蓋，以對(duì)角的順序均勻擰緊鍋蓋上的旋鈕之后，檢查關(guān)閉鍋蓋上的氣閥和所有開(kāi)關(guān)。3）結(jié)束 時(shí)間到后，關(guān)掉電源，停止加熱，讓滅菌鍋內(nèi)壓力自然下降。2）無(wú)菌包不宜過(guò)大，物品不宜放得過(guò)滿過(guò)緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對(duì)流易滲透到包裹中央。5）滅菌結(jié)束時(shí)，不應(yīng)立即放氣，而應(yīng)停止加熱使其自然冷卻 20~30min，使鍋內(nèi)壓力下降至零位（壓力表指針回到零位）后數(shù)分鐘，將放汽閥打開(kāi)，然后略微打開(kāi)鍋蓋（開(kāi)一條縫），人離開(kāi)消毒室，待其自然冷卻到一定程度再將物品取出。苯甲酸的熔點(diǎn)為121~123℃，滅菌后看到苯甲酸粉末變成液態(tài)，冷卻后成固體，表示已達(dá)到滅菌的目的。將滴加細(xì)菌芽胞的紙條、鋁片等載體，放置于滅菌器的不同位置，滅菌后，取出試紙條，接種于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置55～60℃溫箱中培養(yǎng)48h至7天觀察結(jié)果，根據(jù)紙片中芽孢死亡與否來(lái)判斷是否達(dá)到滅菌要求。5．紫外線消毒試驗(yàn) （1）工作原理：細(xì)菌的DNA可以吸收紫外線，使一條DNA鏈上的兩個(gè)胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合形成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡和變異。3）將3個(gè)平板同時(shí)放置紫外燈下，打開(kāi)蓋子，讓紫外燈照射30min。返回時(shí)，應(yīng)先管好燈，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下工作，紫外線對(duì)眼睛和皮膚均有損傷。2．抗菌藥物紙片：~，含有一定量的某種抗菌藥物。4. %麥?zhǔn)媳葷峁? 配制方法如下： BaCl2 (% W/V BaCl2 . 2H2O) H2SO4 (1%, V/V) 將二液置冰水浴中冷卻后混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、 紙片擴(kuò)散法（KB法）藥敏試驗(yàn)1．原理將含有定量的抗菌藥物紙片貼在已接種待測(cè)細(xì)菌的瓊脂平板表面，紙片上的藥物隨即溶于瓊脂中，并沿紙片周圍由高濃度向低濃度擴(kuò)散，形成逐漸減少的梯度濃度。瓊脂厚為4mm（約23~25ml培養(yǎng)基），瓊脂凝固后塑料包裝放4℃保存，在5日內(nèi)用完，使用前應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱放置30min使表面干燥。（4）貼紙片 用無(wú)菌鑷子夾取藥物紙片平貼在種好細(xì)菌的瓊脂表面，每個(gè)平板可貼4~6種藥物紙片。3．結(jié)果觀察和報(bào)告將平板置于黑背景的明亮處，用卡尺從背面精確測(cè)量包括紙片直徑在內(nèi)的抑菌環(huán)直徑，測(cè)得結(jié)果以毫米為單位進(jìn)行記錄，最后參照NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)附錄）進(jìn)行結(jié)果判斷，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐藥（resistant）等程度報(bào)告之。（2）藥物紙片的貼放要均勻，并且要充分接觸瓊脂。（3）菌液濃度也可影響試驗(yàn)的結(jié)果，濃度大細(xì)菌多時(shí)抑菌環(huán)減小；菌量少時(shí)抑菌環(huán)則偏大。（5）試驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按要求操作，嚴(yán)格無(wú)菌操作。標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)每周用MH瓊脂傳代，4℃保存。原液以過(guò)濾法除菌，小量分裝使用，放20℃以下一般可保存三個(gè)月，如果置4℃只能保存一周。3）細(xì)菌接種：將已準(zhǔn)備好的菌液分別加入到上述各試驗(yàn)管和對(duì)照管中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。，經(jīng)35℃培養(yǎng)過(guò)夜后，%的種入菌的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。考慮到抗菌藥物的效力，不同藥物應(yīng)選擇不同的稀釋度。如果標(biāo)準(zhǔn)菌株的試驗(yàn)結(jié)果超過(guò)或低于預(yù)期值一個(gè)稀釋度以上，不應(yīng)發(fā)出臨床報(bào)告，而應(yīng)找出差錯(cuò)的原因。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一個(gè)由mecＡ基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2α）而對(duì)甲氧西林耐藥。因此，開(kāi)展對(duì)MRSA的檢測(cè)，對(duì)于控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行，指導(dǎo)臨床治療有著十分重要的意義。（3）結(jié)果判斷：頭孢西丁紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥20mm為敏感，≤19 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥25 mm為敏感，≤24 mm為耐藥。2）培養(yǎng)溫度應(yīng)為33~35℃，超過(guò)35℃耐藥的葡萄球菌可能被抑制不能生長(zhǎng)而漏檢。產(chǎn)生ESBLs的細(xì)菌主要是大腸埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、陰溝腸桿菌，其他如銅綠假單胞菌、變形桿菌屬及不動(dòng)桿菌屬也可產(chǎn)生。4）質(zhì)量控制：以大腸埃希菌ATCC2