【正文】 .(6)支持介質(zhì)的選擇：(7)其它因素：:(1)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有三種離子，兩種不同孔徑的凝膠，兩種或兩種以上不同pH的緩沖溶液.(2)．所謂不連續(xù)就是指凝膠濃度不一樣，緩沖液離子成分及pH不一樣。 (3)電位梯度的不連續(xù)性：在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度的差異是自動形成的。： SDS作用：1）與蛋白牢固結(jié)合，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS形成的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異；2）SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDSPAGE中，SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與菌、酵母等的破碎。 ：絕大多數(shù)細(xì)胞被破壞，一般適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)。 ：有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子之間不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中沉淀析出。 4）親和層析。 待分離物質(zhì)的存在也不影響其他物質(zhì)的分配；4）在分配層析柱上，物質(zhì)在各個理論塔板中的含量可通過計算求得。 可能出現(xiàn)的問題及解決措施：1）條帶過淡：上樣量不足；染色操作錯誤；2）條帶丟失：電泳時間過長，小條帶已跑出膠；膠濃度不正確。5）條帶位置錯誤：被降解；上樣量過大；電泳條件不正確；上樣前加熱不夠；還原劑失效。9）拖尾：樣品溶解不充分；膠板不干凈。單獨的BD雖然能和啟動子結(jié)合,但不能激活轉(zhuǎn)錄。(2)．具有可直接進行選擇的標(biāo)記基因和特征性報告基因。：1）表達“誘餌”和“獵物”蛋白；2）檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因做法：首先構(gòu)建能表達“誘餌”和“獵物”蛋白的表達載體。原因：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號放大； ④檢測的結(jié)果是基因表達產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。(2)對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。(5) 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜。 原因：①BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用。 排除假陽性的措施：①作嚴(yán)格的對照試驗。③報告基因整合到染色體上，可使基因表達水平穩(wěn)定。 原因：（1）融合蛋白的表達對細(xì)胞有毒性時，應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體；（2）蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。(2)某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。(5) 哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。當(dāng)Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。：原理 ：利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因。在此情況下BDX/ADY作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。 ：基本原理：構(gòu)建3個雜交體：1） BD與一個位點特異的RNA結(jié)合蛋白融合，可結(jié)合到報告基因上；2） RNA(Y)，含有“誘餌”順序，且可結(jié)合到BD融合的蛋白質(zhì)上；3）與AD融合的X蛋白。：(1)有自身的復(fù)制子，能借助自身的復(fù)制和調(diào)控對攜帶的目的基因進行復(fù)制和增殖。：（一）按功能分類：1）克隆型載體； 2）表達型載體。：1）氨芐青霉素抗性基因（ampr）:編碼β內(nèi)酰胺酶，水解amp β內(nèi)酰胺環(huán)使amp失效；2）四環(huán)素抗性基因（tetr）：編碼轉(zhuǎn)膜泵將tet從細(xì)胞移出； 3）大腸桿菌LacZ基因：編碼半乳糖苷酶，分解Xgal，使菌落為藍色。 用途：構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫：1）標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系：1μgDNA，20μl總反應(yīng)體積，1U酶，推薦的Buffer和溫度，反應(yīng)1h； 2）酶切體系組成：內(nèi)切酶 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇，保存，使用，稀釋（避免失活與污染）； DNA底物純度，含量； 反應(yīng)buffer 嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書 高、中、低鹽； 3）酶切溫度與時間：一般為37℃, 1h； 4）酶切反應(yīng)過程：容積：20μl，50μl, 酶容積≤10%, 即甘油≤ 5%；注意混勻；反應(yīng)終止：三種方法 :①10mM %SDS。 主要功能與用途：①催化兩個獨立DNA片段(粘性末端和平末端) 5′P和3′OH之間形成磷酸二酯鍵。 用途：1）主要作用是在載體或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。：1）cDNA文庫(C文庫)用基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的DNA重組體的群體，每一重組子只含一種mRNA信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部mRNA序列。2）適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的蛋白基因。 2）平頭末端連接法：適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。 程序： 限制性內(nèi)切酶消化DNA→瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段→轉(zhuǎn)印到NC膜或尼龍膜→堿變性、中和→預(yù)雜交、雜交→放射性自顯影. 其基本原理毛細(xì)管轉(zhuǎn)移: 將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進行雜交。具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的條件（溫度及離子強度）下可以按堿基互補配對的原則退火形成雙鏈分子，由此可用來檢測核酸分子存在與否。:(1).高度靈敏性。(5).標(biāo)記及檢測方法簡單。 缺點：1）半衰期短, 隨用隨標(biāo)；2）放射性污染。:(1)DNA的切口平移標(biāo)記法。(5)cDNA探針的標(biāo)記：在反轉(zhuǎn)錄過程中選用反轉(zhuǎn)錄酶, 加入標(biāo)記的核苷酸, 引物可以特定的,也可以是隨機六核苷酸, 或oligo dT。:酶法(U)與化學(xué)法(C)生物素標(biāo)記方法:參入標(biāo)記法(隨機引物法或缺口翻譯法)與光敏生物素標(biāo)記法。七、DNA的P C R：類似于DNA的天然復(fù)制過程，是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5`末端和3`末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板鏈延伸，直至完成新的DNA合成，反復(fù)重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。(3)．引物的延伸 (extension)：DNA聚合酶在最適溫度下催化DNA合成反應(yīng)。：1）高度的敏感性：是最主要的特點，25個循環(huán)可擴增106倍，它可對單拷貝、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進行分析；2）高度的特異性：取決于2個引物設(shè)計的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性，退火溫度；3）操作簡便、快捷；4）適用樣品的廣泛性。：1）引物長度在15～30個堿基；2）引物的堿基的分布是隨機的, 避免5個以上的嘌啶和嘧啶的連續(xù)排列, 尤其3 39。決定產(chǎn)物的特異性；6）引物的5 39?！捌脚_效應(yīng)”出現(xiàn)的早晚取決于：1。其他多種因素7. PCR的條件優(yōu)化：1）PCR循環(huán)數(shù)；2）使用增強劑（DMSO，PEG6000，甲酰胺，甘油，Tween20）；3）熱啟動PCR。 2)轉(zhuǎn)染:（一）化學(xué)法:磷酸鈣共沉淀法, DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法, 脂質(zhì)體介導(dǎo)法, 醋酸鋰法. （二）物理法:電穿孔技術(shù), 顯微注射技術(shù).：1）瞬時表達（瞬時轉(zhuǎn)染），特點：外源DNA未與宿主染色體整合，維持時間短(23天)； 2）穩(wěn)定表達（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染），特點：外源DNA已整合入宿主細(xì)胞染色體, 其轉(zhuǎn)染的目的是獲得穩(wěn)定表達外源目的基因的單細(xì)胞克隆。3）. 篩選標(biāo)記的選擇；4）. 宿主選擇: 依據(jù)啟動子與宿主的相容性來選擇。：1）質(zhì)粒載體；2）桿狀病毒載體系統(tǒng)。大多含polyhedrin基因啟動子和外源插入位點，在啟動子上游（5 ’旁側(cè)）及外源插入基因下游（3’旁側(cè)）均有病毒基因序列。：1）啟動子：Ⅱ類啟動子常由TATA盒和部分上游啟動子元件組成；是TF ⅡD識別部位。特點：能遠(yuǎn)距離增強啟制動子的活性； 無方向性，在啟動子的上游和下游均起作用； 對啟動子的影響無嚴(yán)格的專一性。4）其調(diào)節(jié)機涉及順式作用元件、RNA聚合酶和其它調(diào)節(jié)蛋白。按不同組合，估計需轉(zhuǎn)錄因子３００余個即可。2）反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：多數(shù)：先激活后結(jié)合。：1）5′帽子結(jié)構(gòu)的作用：防止mRNA被5′→ 3′核酸酶降解；能被帽結(jié)合蛋白識別，增強mRNA的可翻譯性，沒帽子結(jié)構(gòu)，翻譯效率降低；促進mRNA從核到胞漿的運輸過程；增強mRNA的剪接效率, 帽對exon1的剪接尤為重要，需要2個帽結(jié)合蛋白參與（CBP80和CBP20）。(2)SD序列，且SD序列與AUG之間有合適距離（轉(zhuǎn)譯效率嚴(yán)格依賴于此）。(3).原核細(xì)胞缺乏RNA轉(zhuǎn)錄后加工的能力，所以真核目的基因為mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。(2). 附加物的選取: 附加物有表位標(biāo)簽{如(His)GST、GFP等等。 ：大腸桿菌（）；芽孢桿菌（Bacillus）；鏈霉菌（streptomyces）。宿主本身雜蛋白多，不利于提取。3）啟動子具有可調(diào)控性，本底轉(zhuǎn)錄水平低。6）SD序列，且SD序列與ATG之間有合適距離。2）增加mRNA的穩(wěn)定性。D）.采用融合表達或串聯(lián)表達。：尋找差異表達的基因。：需要大量測序；過程復(fù)雜；步驟多；可能丟失短的基因片段；提供信息有限； (3).差異顯示PCR法：；：快速、所需RNA量少；：假陽性率高；對高拷貝基因有偏向性；所獲得的片段太短。 代表性差異分析技術(shù)的缺點：低豐度的身雜交的幾率很低；酶切連接步驟多，損失大；得不到全長cDNA。十、基因診斷、基因治療：1） 特異性強； 2）靈敏度高； 3）早期診斷； 4）檢測樣品局限性??；5） 應(yīng)用范圍廣。3） 檢測手段: 非常規(guī)的顯色或放射自顯影。2）用途: ISPCR把PCR+原位雜交（ISH）技術(shù)這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。(single strand formation polymorphism, SSCP)：1）分析原理：單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象，在中性PAGE中的電泳遷移率不同，與正常的電泳圖型對照，新生條帶出現(xiàn)即可判定存在堿基變異。一般只限于檢測300bp以下的片段。1）作ASOH時，針對每種突變位點，分別合成2個寡核苷酸探針；其中一個能與正常序列完全互補，另一個則與具有突變的堿基序列完全互補；2）預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色；使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，有錯配的探針則被洗脫，不顯示雜交信號；3）分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷。2）基因較大且多位點(位點間距離較遠(yuǎn))存在插入或缺失，宜采用多重PCR法檢測。不能形成胎兒HbF，但形成γ 4，稱為Hb Bart ( γ 4) 。（C）輕型(標(biāo)準(zhǔn)型) a 地中海貧血：基因型：a a/ (a0地貧雜合子)或 a / a (a+地貧純合子)。靜止型 a 地貧與輕型 a 地貧個體婚配，可有1/4機會生育Hb H病患兒。受體細(xì)胞的培養(yǎng)224?；蛑委煹陌踩员O(jiān)測和療效評價.(方法)的選擇：1）直接法(體內(nèi)法) ( in vivo )：特點：直接向體內(nèi)某組織(器官)轉(zhuǎn)基因。優(yōu)點：成功率相對較高；缺點：操作繁瑣。2）病毒學(xué)方法： 是指以重組病毒為載體，通過感染將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法。 能有效轉(zhuǎn)錄的真核DNA序列連鎖時, 就能獲得有效表達, 從而產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418失活。2）基因添加：在不去除異?；虻那疤嵯?， 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞(非定點整合)，以目的基因的表達產(chǎn)物來補償缺陷基因的功能或使原來的功能得到加強。(ribozyme)技術(shù)：核酶催化部份和底物部份組成錘頭結(jié)構(gòu)。(ADA)缺陷病的基因治療：1），基因全長32kb， mRNA長1 530bp。ADA gene表達224。2）腫瘤細(xì)胞的基因“修飾”。：(1).制作方式：(前者為別處合成和收集探針，后固化；后者是原位化學(xué)合成；(2).探針類型：(前者可用常規(guī)分子生物學(xué)方法合成的任一種探針,后者為化學(xué)合成寡核苷酸)；(3).探針長度：(前者為后者的十倍到幾十倍)；(4).探針集成度：(前者低，后者高)；(5).技術(shù)保密性(只有后者受專利保護)。(4)掃描與圖像分析，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理與分析。更換另一掩模(M2)，激光點光源照射下一個位點224。 壓印獲得芯片(特定位點)224。4）雜交信號強度∝ (樣品)靶基因的量。6）雜交反應(yīng)條件與反應(yīng)條件的優(yōu)化。 后續(xù)步驟： 終止反應(yīng)224。溶解樣品。：特定的細(xì)胞釋放信息物質(zhì)224。靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。 （MAPK）：1）MAPK是蛋白激酶家族,包括ERK,JNK和p38MAPK三個亞家族；2）激活級聯(lián)反應(yīng)：MAPKKK(Raf) →MAPKK(MEK) →MAPK(ERK) →生理作用。3）PTK與細(xì)胞生長、增殖、癌變有關(guān)。巳知17種α亞基,5種β亞基,7種γ亞基,故G蛋白是一個大家族。2）其作用與蛋白激酶相反，）抑癌基因產(chǎn)物PTEN是一種磷酸酶，可使PIP3脫磷酸化為PIP2，也可催化蛋白質(zhì)中磷酸酪氨酸或絲/蘇氨酸脫磷酸(PLC) ：PIP2＋H2O－→IP3＋ DAG(PIK) ：不同的kinase 利用ATP催化PI逐級磷酸化 PI→PI4P→PI(4,5)P2 → PI(3,4,5)P3。3）PI（5）P3似與細(xì)胞生長、分裂、癌變、運動有關(guān)(NOS) ：L精氨酸＋2NADPH＋2O2→L瓜氨酸＋NO+2H2O：1）膜受體：存在于細(xì)胞質(zhì)膜上的受體，絕大部分是鑲嵌糖蛋白。：1）高度專一性；2）高度親和力；3）可飽和性；4）可逆性；5）特定的作用模式。受體224。蛋白激酶224。 2）Ca2+－ CaM激酶途徑組成:受體、G蛋白、PLC、IPCa2+、鈣調(diào)蛋白、CaM激酶。：1）組成:受體，鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，cGMP, 蛋白激酶G (PKG)。2）JAKsSTAT途徑(多種細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)組成:非催化性受體，JAKs (janus kinases)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激動子 (S