第二章基因工程制藥(二)-全文預(yù)覽
【正文】 糖和甘油對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)于分泌型菌更為有利。 由于基因工程菌不穩(wěn)定，可將生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開(kāi)，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。 通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。 由于菌體中小分子前體量和催化結(jié)構(gòu)是有限的，因而生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，限制了菌體的比生長(zhǎng)速率,35,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響,同樣培養(yǎng)基當(dāng)中，工程菌的比生長(zhǎng)速率低于其宿主細(xì)胞。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。,31,第二章 基因工程制藥,菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系,碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。 工程菌培養(yǎng)可通過(guò)選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)。 調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。,23,第二章 基因工程制藥,質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因,常見(jiàn)的是分裂不穩(wěn)定，與兩個(gè)因素有關(guān)： 含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差異的大小。,18,第二章 基因工程制藥,宿主菌株的影響,菌體生長(zhǎng)力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定 分泌能力強(qiáng),19,第二章 基因工程制藥,動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá),優(yōu)點(diǎn)： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng) 液中，使產(chǎn)物易純化。 終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺苷酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。 精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。 缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高， 信號(hào)肽不被切割。 優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性。 缺點(diǎn)：只能作抗原用。 優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。第二章 基因工程制藥 (二）,1,第二章 基因工程制藥,影響目的基因在大腸桿菌中 表達(dá)的因素,外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物。,5,第二章 基因工程制藥,細(xì)胞的代謝負(fù)荷,外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒性。,6,第二章 基因工程制藥,工程菌的培養(yǎng)條件,除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。,9,第二章 基因工程制藥,非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因,非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。 優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不 含蛋氨酸殘基。,12,第二章 基因工程制藥,載體的復(fù)制系列,分四類(lèi)： Yep類(lèi)（yeast episomal plasmid，酵母附加體質(zhì)粒） YRp類(lèi)（yeast replication plasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒） YCp類(lèi)（yeast centromeric plasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒） YIp類(lèi)（yeast integrative plasmid，酵母整合型質(zhì)粒）,13,第二章 基因工程制藥,表達(dá)載體,普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，
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