第二章基因工程制藥(一)-全文預(yù)覽
【正文】 表達(dá),基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體（vector)把供體DNA（外源基因）運(yùn)載到受體細(xì)胞內(nèi)，從而復(fù)制擴(kuò)增大量的目的DNA分子或轉(zhuǎn)錄表達(dá)為相應(yīng)的產(chǎn)物。 缺點(diǎn)：生長慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度稀。 能正確進(jìn)行翻譯后加工。 其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。 蛋白質(zhì)不能糖基化。,34,第二章 基因工程制藥,原核細(xì)胞－大腸桿菌,因?yàn)榇竽c桿菌的分子遺傳學(xué)研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。 費(fèi)用較高。 其先決條件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA 的堿基序列。 用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。 然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。 選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。 根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體。,19,第二章 基因工程制藥,cDNA第二鏈的合成,此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。,18,第二章 基因工程制藥,cDNA第二鏈的合成,先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNAmRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。,16,第二章 基因工程制藥,cDNA第一鏈的合成,一般mRNA都帶有3‘polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。,13,第二章 基因工程制藥,逆轉(zhuǎn)錄法的步驟,mRNA的純化 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成 cDNA克隆 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 cDNA文庫的鑒定 目的cDNA克隆的分離和鑒定,14,第二章 基因工程制藥,mRNA 的純化,細(xì)胞內(nèi)含有三種RNA，mRNA 占RNA 總量的2%5%，相對分子量大小不一致，分離也有很大的困難。 另外，真核基因一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA 轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 也不能被加工、拼接成為成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成； 下游技術(shù)：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。,3,第二章 基因工程制藥,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的藥物,包括醫(yī)用活性蛋白和多肽： 免疫性蛋白，各種抗原和單克隆抗體； 細(xì)胞因子，干擾素、白介素、生長因子； 激素: 胰島素、生長激素； 酶類: 尿激酶、鏈激酶、蚓激酶、超氧化物歧化酶。第二章 基因工程制藥 (一）,1,第二章 基因工程制藥,一、概述,生物技術(shù)的核心就是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。 癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過基因工程技術(shù)獲得。,7,第二章 基因工程制藥,基因工程藥物制造的主要程序,獲得目的基因,組建重組質(zhì)粒,構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞,培養(yǎng)工程菌,產(chǎn)物分離純化,除菌過濾,半成品檢驗(yàn),成品檢驗(yàn),原料包裝,8,第二章 基因工程制藥,9,第二章 基因工程制藥,基因工程藥物生產(chǎn)的上游和 下游技術(shù),上游技術(shù)：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。
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