【正文】 鈣、磷酸氫二鈉。（3）鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀。草酸溶解度較小，故用量大時(shí)，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。 數(shù)據(jù)檢測(cè)：純化工程中往往在進(jìn)一步加工前需要測(cè)試在制品的某些指標(biāo)的具體數(shù)值，根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，確定下一道工序的工藝參數(shù)后才繼續(xù)加工，這種檢測(cè)即為數(shù)據(jù)檢測(cè)。 （2）初步分離 ：目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，為后來(lái)精制工序創(chuàng)造有利條件。誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響誘導(dǎo)時(shí)間：加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時(shí)間 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對(duì)重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。前期是菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。 工程菌的獲得工程菌應(yīng)具備的條件工程菌的應(yīng)用：利用基因工程菌生產(chǎn)的特點(diǎn)v基因工程菌帶有外源基因，外源基因可能在質(zhì)粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩(wěn)定。交聯(lián)法：可得到高細(xì)胞濃度，但機(jī)械強(qiáng)度低，無(wú)法再生，不適于實(shí)際應(yīng)用。 六、固定化方法的比較吸附法：條件溫和、方法簡(jiǎn)便、載體可再生。適用于一種酶催化的反應(yīng)。是在酶固定化基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。酶分子 + 含有離子交換基團(tuán)的固相載體 第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：DEAE — Cellulose固定化過(guò)氧化氫酶 第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：DEAESephadex A50固定化氨基?；福ㄈ┠z格包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。 五、固定化酶和固定化細(xì)胞發(fā)酵什么是固定化酶 ？固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：多次使用、可以裝塔連續(xù)反應(yīng)、純化簡(jiǎn)單、提高產(chǎn)物質(zhì)量、應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)：酶在固定化中易失活、首次投入成本高、大分子底物較困難制備固定化酶的方法（一）微型膠囊法：是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。 目前對(duì)于具有協(xié)同作用關(guān)系的菌株篩選和組合還是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程的，缺乏有效的理論指導(dǎo)，而且對(duì)于已經(jīng)應(yīng)用的混合培養(yǎng)體系也不能有效地協(xié)調(diào)菌間的關(guān)系，使其達(dá)最佳生態(tài)水平，發(fā)揮最大效應(yīng)。典型的例子是傳統(tǒng)酒曲和醬油、腌萊、煙草發(fā)酵、茶葉發(fā)酵、青貯、堆肥等。 固態(tài)發(fā)酵中微生物生長(zhǎng)在缺乏或幾乎不可見(jiàn)液體水的顆粒之間，在固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)中，微生物可以從濕的基質(zhì)顆粒中獲得所需的水分。從生物反應(yīng)過(guò)程的本質(zhì)考慮，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過(guò)程，而液態(tài)發(fā)酵是以液相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過(guò)程。菌種發(fā)生變異的可能性較大；216?？刂葡♂屗俾士梢允拱l(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化，提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量；216。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)。 補(bǔ)料—分批發(fā)酵的缺點(diǎn)216?？梢酝ㄟ^(guò)補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件；216。 在此過(guò)程中只有料液的加入沒(méi)有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開(kāi)始時(shí)有所增加。對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期就開(kāi)始合成并積累，而次級(jí)代謝產(chǎn)物則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期和穩(wěn)定期大量合成。改變的主要參數(shù)有菌體繁殖代數(shù)、種子的形成、培養(yǎng)基的滅菌、通氣和攪拌，以及熱傳遞等3 放大的方法 從小規(guī)模的操作條件到大規(guī)模的放大過(guò)程，主要以單位體積輸入功率相等和保持K Lα值不變?yōu)榛A(chǔ)進(jìn)行。(3)菌絲受機(jī)械損傷的差異搖瓶培養(yǎng)時(shí)，菌體只受液體的沖擊或沿著瓶壁滑動(dòng)的影響，機(jī)械損傷很小。由于K d值不同，使各自培養(yǎng)液中溶解氧的濃度也不同、因而對(duì)菌體代謝會(huì)產(chǎn)生重要的影響。發(fā)酵過(guò)程的放大將實(shí)驗(yàn)室和中試車(chē)間試驗(yàn)所取得的研究結(jié)果應(yīng)用到大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中的過(guò)程稱之為放大(scale up)。：： ①液體培養(yǎng)法：液體試管、三角瓶搖床震蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)； ②表面法培養(yǎng)：液體表層，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤(pán)培養(yǎng)。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。介質(zhì)過(guò)濾：捕集粒子及各種微生物。連續(xù)滅菌的特點(diǎn)1）高溫快速滅菌工藝，營(yíng)養(yǎng)成分破壞的少；2）熱能利用合理，易于自動(dòng)化控制3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。營(yíng)養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。微生物濃度與滅菌時(shí)間成正比，濃度越高，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)。 致死溫度：殺死微生物的極限溫度。種類：紫外線等射線：局部空間 干熱滅菌：實(shí)驗(yàn)室器皿 蒸汽滅菌：培養(yǎng)基效果好，操作方便，廣泛使用。化學(xué)滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機(jī)化合物等。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。④ 所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。 （5）水水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。有機(jī)氮源成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子。注：不同碳源對(duì)微生物自身生長(zhǎng)、發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生不同的影響。 來(lái)源：糖類、油脂、有機(jī)酸、正烷烴工業(yè)上常用的糖類：① 葡萄糖：所有的微生物都能利用葡萄糖，但是會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)； ② 糖蜜：糖蜜是制糖生產(chǎn)時(shí)的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的 副產(chǎn)物。培養(yǎng)基的配制 ：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖所需的一組營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和原料。鑒定的方法有直接篩選法和分子生物學(xué)間接篩選法。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。轉(zhuǎn)化：指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過(guò)程。目的基因與載體DNA均采用限制性內(nèi)切酶處理，然后在DNA連接酶催化下，兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’磷酸和3’羥基間形成磷酸二酯鍵，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體。選擇載體載體（Vector）是攜帶目的基因并將其轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的運(yùn)載工具。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長(zhǎng)，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。原生質(zhì)體融合育種步驟：1．標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion）：用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體相互接觸、融合，經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交目的，經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子（fusant）。這種方法適用范圍很廣，在酒類、面包、藥用和飼料酵母的育種，鏈霉菌和青霉菌抗生素產(chǎn)量的提高，曲霉的酶活性增強(qiáng)等方面均已獲得成功。這種育種方法稱為雜交育種。特殊變異菌株的篩選方法：特殊變異菌株，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗性突變菌株、溫度敏感突變株、組成型突變株等。一般只能定性或半定量用，常只用于初篩，可以大大提高篩選的效率。盡管相當(dāng)多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。出發(fā)菌株開(kāi)始時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑。自然狀態(tài)下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率僅為108～109，出現(xiàn)優(yōu)良性狀的可能較小，需堅(jiān)持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才能收到效果。以熱穩(wěn)定蛋白酶產(chǎn)生菌篩選為例：將選出的菌落接液體試管進(jìn)行微量培養(yǎng)，以對(duì)硝基苯胺短肽衍生物為反應(yīng)底物，在96孔板中65℃下反應(yīng)10min和40min，分別用微孔讀板儀測(cè)定酶活，然后用兩種酶活的比值作圖來(lái)代表酶的熱穩(wěn)定性，選出熱穩(wěn)定性高的菌株。該法可分離到許多放線菌。具體方法是：取風(fēng)干并破碎的土樣1g，加如無(wú)菌水10mL，劇烈震搖1min，然后靜置1min，使粗砂粒沉淀，吸取上面的懸浮液1mL，用無(wú)菌水進(jìn)行系列梯度稀釋，涂布于分離平板上培養(yǎng)。分離放線菌時(shí)，在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、鏈霉素（抑制G菌）各30～50U/ml，以及丙酸鈉10μg/ml（抑制霉菌類）抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)。從土壤中分離芽孢桿菌時(shí)，由于芽孢具有耐高溫特性，100℃很難殺死，要在121℃才能徹底死亡。如細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)繁殖一般要求偏堿（～），霉菌和酵母菌要求偏酸（～6）。采土方式——在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，除去表土，取離地面515cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。5生產(chǎn)性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。2工業(yè)上重要真菌：酵母菌、霉菌、蕈菌五、極端微生物極端微生物（extremophiles），也叫極端環(huán)境微生物，是最適合生活在極端環(huán)境中的微生物的總稱，包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿、嗜壓、嗜鹽、抗輻射、耐干燥和極端厭氧等多種類型嗜熱菌的最著名的產(chǎn)品：Taq酶第二節(jié) 菌株的分離與篩選一、新種分離與篩選的一般步驟：1定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性，設(shè)計(jì)合理的篩選方案。放線菌實(shí)際上是屬于細(xì)菌范疇內(nèi)的原核微生物，只不過(guò)其細(xì)胞形態(tài)為分枝狀菌絲。 微生物技術(shù)應(yīng)用微生物技術(shù)與應(yīng)用核心知識(shí)第1章緒論微生物技術(shù)的概念：所有直接或間接的利用微生物、微生物的機(jī)能、微生物的組成部分或其代謝產(chǎn)物（如酶）來(lái)加工生產(chǎn)產(chǎn)品，或?yàn)樯鐣?huì)提供服務(wù)的技術(shù)。第2章 微生物資源開(kāi)發(fā)與菌株選育第一節(jié) 常用微生物的類群一、工業(yè)化菌種應(yīng)符合下述要求：q能夠利用廉價(jià)的原料，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物q有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡(jiǎn)單，或者說(shuō)菌種改造的可操作性要強(qiáng)q遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定q不易感染它種微生物或噬菌體q產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無(wú)關(guān)）q生產(chǎn)特性要符合工藝要求二、工業(yè)上重要細(xì)菌：埃希氏大腸菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈孢囊菌屬、芽孢梭菌、鏈球菌三、放線菌1概念：放線菌（Actinomyces）是指在形態(tài)上具有分枝狀菌絲、菌落形態(tài)與霉菌相似，以孢子進(jìn)行繁殖的原核微生物。1真菌：具有細(xì)胞壁，不含葉綠素，無(wú)根莖葉的分化，以產(chǎn)生大量孢子進(jìn)行繁殖，以寄生或腐生方式生存的真核微生物。4分離：利用分離技術(shù)得到純種。 采樣季節(jié)——以溫度適中，雨量不多的秋初為好。2 控制培養(yǎng)條件：在篩選某些微生物時(shí)，除通過(guò)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的選擇外，還可通過(guò)它們對(duì)pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達(dá)到有效的分離目的。3抑制不需要的菌類：通過(guò)高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達(dá)到富集的目的。篩選霉菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素等抗生素抑制細(xì)菌，使霉菌在樣品的比例提高，從中便于分離到所需的菌株。2．水懸浮稀釋法：又稱濕法分離，是最常用的一種分離土壤微生物的方法。孢子飛揚(yáng)法：是將土樣置于一種瓶口剛好能倒扣一個(gè)分離平版的特制瓶中，距離振蕩使孢子飛揚(yáng)，撞在分離平板上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。高通量篩選技術(shù)的關(guān)鍵是建立一種微量、靈敏、可自動(dòng)化操控的篩選模型。一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。誘變育種的不足是缺乏定向性。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 （2）誘變處理方式單一因子處理復(fù)合因子處理：兩種以上因素先后使用、同時(shí)使用或單一因子重復(fù)使用 菌種經(jīng)誘變處理后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的突變類型，需要選擇一定的篩選方式，將具有所需性狀的突變株篩選出來(lái)。突變株的常用篩選方法：A菌體形態(tài)變異分析：有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一