【正文】 定的相關(guān)性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來(lái)。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等。但是搖瓶培養(yǎng)法需要較多的勞力、設(shè)備和時(shí)間，所以，搖瓶培養(yǎng)法常用于復(fù)篩。（四）雜交育種：不同基因型的品系或種屬間，通過(guò)交配或體細(xì)胞融合等手段形成雜種，或者是通過(guò)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)形成重組體，再?gòu)倪@些雜種或重組體或是它們的后代中篩選優(yōu)良菌種。1雜交法：一般指有交配反應(yīng)的菌株進(jìn)行交配或接合而形成雜種。原生質(zhì)體融合育種技術(shù)原生質(zhì)體（Protoplast）：采用一定方法技術(shù)去掉細(xì)胞壁，剩下的細(xì)胞部分稱之為原生質(zhì)體。提高菌株產(chǎn)量的潛力較大 原生質(zhì)體融合時(shí)親本整套染色體參與交換，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親本優(yōu)良性狀機(jī)會(huì)更大。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。 基因工程育種的特點(diǎn)：q打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制 q可進(jìn)行定向變異和育種 q可創(chuàng)造出自然界中原本沒有的生物 基因工程育種的基本步驟： 目的基因的獲得選擇目的基因的途徑有4種：①選擇適宜的給體細(xì)胞,以便從中采集分離到有生產(chǎn)意義的目的基因；②通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成cDNA(互補(bǔ)DNA)；③通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段；④用化學(xué)方法合成特定功能的基因。目的基因與載體連接獲得目的DNA片段和載體DNA片段后，要把兩者連接起來(lái)形成重組體。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。轉(zhuǎn)染和感染：利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。陽(yáng)性重組子的篩選、鑒定長(zhǎng)出的菌落不一定都是含有正確目的DNA片段的陽(yáng)性重組子，因此需要從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選、鑒定出含有陽(yáng)性重組子的菌落?？諝饪諝鈨艋幚肀２鼐N斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)物分離純化成品滅菌發(fā)酵類別：v根據(jù)對(duì)氧的需要區(qū)分：厭氧和有氧發(fā)酵v根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀區(qū)分：液體和固體發(fā)酵v根據(jù)微生物生長(zhǎng)特性區(qū)分：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵的一般流程 (1)用作培養(yǎng)菌種及擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制；(2)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌；(3)將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中；(4)將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長(zhǎng)并形成代謝產(chǎn)物；(5)將產(chǎn)物抽提并進(jìn)行提純，以得到合格的產(chǎn)品；(6)回收或處理發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的廢物和廢水。促進(jìn)產(chǎn)物的形成 （1）碳源作用：提供微生物菌種的生長(zhǎng)繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分；提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分。優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源廣泛、價(jià)格底；難利用，可以解除葡萄糖效應(yīng)。 無(wú)機(jī)氮源無(wú)機(jī)氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無(wú)機(jī)氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無(wú)機(jī)氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。產(chǎn)物促進(jìn)劑：是指那些非細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。③ 培養(yǎng)基的原料應(yīng)因地制宜，價(jià)格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購(gòu)運(yùn)輸，適合大規(guī)模儲(chǔ)藏，能保證生產(chǎn)上的供應(yīng)。3培養(yǎng)基滅菌：是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。 5滅菌的方法、原理（1）化學(xué)滅菌：用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。（2）物理滅菌：各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過(guò)濾等進(jìn)行滅菌。當(dāng)溫度超過(guò)最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡，加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進(jìn)行的。相對(duì)熱阻：指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。缺點(diǎn)：加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)。 加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。靜電除菌：通過(guò)高壓電流場(chǎng)，帶電粒子被吸附。v離心場(chǎng)作用：顆粒及其微生物沉降??v直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆粒。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。控制參數(shù)：1．溫度 2．pH值 3．氧 發(fā)酵中判斷放罐的大要指標(biāo)：有產(chǎn)物濃度、過(guò)濾速度、氨基氮、菌絲形態(tài)、pH、發(fā)酵液的外觀及黏度等；一般菌絲自溶前總有跡象，如氨基氮開始升高、pH上升、菌絲碎片增多、黏度增加、過(guò)濾速度降低等，其中最后一項(xiàng)對(duì)染菌罐尤為重要。發(fā)酵罐中的K d值一般都大于搖瓶。發(fā)酵罐發(fā)酵是處于正壓狀態(tài)，而搖瓶基本上處于常壓狀態(tài)，所以罐中培養(yǎng)液的CO2濃度明顯大于搖瓶，而CO2對(duì)細(xì)胞呼吸和某些微生物代謝產(chǎn)物的生物合成有著較大的影響。 發(fā)酵罐規(guī)模改變的影響發(fā)酵罐規(guī)模的變化，導(dǎo)致很多物理和生物參數(shù)的改變。微生物生長(zhǎng)分為：遲滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和死亡期。二、補(bǔ)料分批發(fā)酵 定義：又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過(guò)程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式，以克服營(yíng)養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過(guò)早結(jié)束的缺點(diǎn)。在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；216。不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問題。存在一定的非生產(chǎn)時(shí)間；216。能維持低基質(zhì)濃度；216。：216。四、固態(tài)發(fā)酵：是指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物發(fā)酵的一個(gè)生物反應(yīng)過(guò)程。本質(zhì)區(qū)別是以氣相還是以液相為連續(xù)相的差異，具體表現(xiàn)是固體發(fā)酵基質(zhì)中游離水的多少。自然富集固態(tài)發(fā)酵：是指利用自然界中的微生物，由不斷演替的微生物進(jìn)行的富集混合發(fā)酵過(guò)程。 限定微生物混合固態(tài)發(fā)酵：是在對(duì)微生物相互作用和群落認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，接種混合培養(yǎng)的微生物是已知和確定的，通常使用兩種或兩種以上經(jīng)過(guò)分離純化的微生物純種，同時(shí)或先后接種同一滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中，在無(wú)污染條件下進(jìn)行的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程。它對(duì)于擴(kuò)大固態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用范圍和潛力的發(fā)揮起到非常重要作用，同時(shí)，也是固態(tài)發(fā)酵一個(gè)重要方向。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。 酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子區(qū)別：（a）共價(jià)交聯(lián)：酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）共價(jià)偶聯(lián)：酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶固定化細(xì)胞一、定義：是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具備能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。：（1）死細(xì)胞：包括完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器。五、細(xì)胞固定化的方法細(xì)胞固定化方法有：吸附、共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)、包埋、微膠囊。但由于試劑的毒性，易引起細(xì)胞的破壞。 第三節(jié) 基因工程菌的發(fā)酵何謂基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。v基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。偏堿性的pH對(duì)外源蛋白的表達(dá)不利，因此，以保證外源蛋白的高水平表達(dá)。 ： 發(fā)酵的下游加工過(guò)程可以下過(guò)程： （1）預(yù)處理和固液分離 ：目的是分離菌體和其他懸浮顆粒；除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液性質(zhì)，以利于提取和精制的順利進(jìn)行。 三、分離純化方法的綜合運(yùn)用與工藝優(yōu)化1 收率與純度之間的平衡2 經(jīng)濟(jì)性考慮3 工藝放大4 純化過(guò)程中對(duì)產(chǎn)品的檢測(cè)在線檢測(cè)：在工藝運(yùn)行過(guò)程中，通過(guò)對(duì)在制品取樣并用適當(dāng)儀器和方法檢測(cè)試樣品相應(yīng)指標(biāo)、或通過(guò)安裝在生產(chǎn)設(shè)備上的檢測(cè)儀器（如感應(yīng)探頭等）直接檢測(cè)加工物料或設(shè)備的有關(guān)數(shù)據(jù)，以了解工藝運(yùn)行狀況，并對(duì)其進(jìn)行調(diào)整和控制。 （1）鈣離子，可用草酸。此法可用于環(huán)絲氨酸的提取。（2）方法：在稀溶液中加入電解質(zhì)以促進(jìn)凝聚和絮凝。 對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過(guò)濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液，對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)行細(xì)胞碎片的分離。167。（一）鹽析法在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過(guò)程。：通常采用實(shí)驗(yàn)的方法確定。常用的有機(jī)溶劑沉析劑：乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇。攪拌速度：散熱167。樣品濃度: ~2%167。原理：利用兩性分子上的電中性時(shí)溶解度最低，而各種兩性分子具有不同等電點(diǎn)而進(jìn)行分離的一種方法。同時(shí)，?？芍苯舆M(jìn)行其他純化操作，無(wú)需將殘余的酸除去。超速離心技術(shù)已成為分離、純化、鑒別和各種生物大分子的重要手段之一 。垂直轉(zhuǎn)頭167。（四）離心方法 1 差速沉淀離心差速沉淀離心系指分步改變離心速度，用不同強(qiáng)度的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分批沉淀分離的方法，它主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒，對(duì)于差別較小的物質(zhì)，差速離心難以得到滿意的分離效果。由于這種方法是根據(jù)顆粒的沉降速率來(lái)完成分離，且離心過(guò)程中形成區(qū)帶，所以稱作速度區(qū)帶離心。167。由于這種離心是將樣品顆粒沉降到介質(zhì)中與其浮力密度相等的密度梯度區(qū)，故名之等密度離心或平衡離心。膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。微濾（MF）：以多孔細(xì)小薄膜為過(guò)濾介質(zhì)，壓力差為推動(dòng)力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，~14μm之間，主要用于微粒和細(xì)菌的過(guò)濾；167。納濾（NF）：以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離300~1000小分子量的膜分離過(guò)程，孔徑分布在平均2nm，在氨基酸生產(chǎn)、抗生素回收等方面有廣泛應(yīng)用。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。2 吸附劑167。（四）分配層析技術(shù)原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。2 凝膠的種類和性質(zhì)（1）交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex）（2）瓊脂糖凝（3）聚丙烯酰胺3 凝膠過(guò)濾在實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化 2）分子量的測(cè)定3）分級(jí)分離 4）溶液濃縮 5）細(xì)胞及顆粒的分離（六）離子交換層析法1原理：根據(jù)離子交換樹脂對(duì)需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來(lái)。（二）原理 被分離組分在兩液相中的分配系數(shù)具有較大的差異。凍干制劑應(yīng)具有多孔性、疏松、易溶的特點(diǎn)，一般含水量在1%3%。4 生化工程在線檢測(cè)和建模方法的發(fā)展代謝控制發(fā)酵得以出現(xiàn)和發(fā)展、基因工程理論和技術(shù)的成熟、代謝流定量分析技術(shù)的發(fā)展、生化工程在線檢測(cè)和建模方法的發(fā)展最終使得代謝控制發(fā)酵學(xué)科的建立和發(fā)展。在這條載流途徑上流動(dòng)的代謝主流對(duì)應(yīng)地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。（二）代謝工程要解決的問題要解決的問題就是改變代謝途徑中的物質(zhì)流向，或者改變物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布。（五）代謝工程理論涉及的內(nèi)容涉及生物化學(xué)原理、化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)和控制學(xué)原理、酶學(xué)原理、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)原理、細(xì)胞生物學(xué)原理、生化工程和化學(xué)工程的原理、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)原理。第二，分析技術(shù)。傳統(tǒng)代謝工程的直線思維模式在改造復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)在遇到上述困難時(shí)已無(wú)能為力。20