【正文】 , 建立了免疫熒光檢測(cè)技術(shù) ,但該方法需昂貴設(shè)備 ,結(jié)果易受主觀影響 ,難以在常規(guī)工作中應(yīng)用。禽流感的臨診癥狀變化很大 ,臨床診斷常難以定性 ,必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷。臨床資料顯示：戊肝多見于中老年，有 % ALT 先恢復(fù)正常，爾后黃疸消退；甲肝以青壯年多見，有 %患者黃疸先消退，爾后谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)恢復(fù)正 常。 （摘自：中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志 2020年 7月第 24卷第 4期） 盧龍縣戊性肝炎流行特征調(diào)查 蔡芳 為了解本地區(qū)戊型肝炎 (HE)流行特征， 1994年 5月至 1995年 4月對(duì) 1 57例散發(fā)性肝炎病人和 57例急性暴發(fā)流行的肝炎病人進(jìn)行戊性肝炎的病原和流行病學(xué)調(diào)查。而酶聯(lián)免疫法采用酶作為標(biāo)記物，通過 顯色強(qiáng)度反映待測(cè)物質(zhì)的濃度，由于許多因素影響酶和底物的活性，因而試劑的穩(wěn)定性、靈敏度略顯不足。電化學(xué)發(fā)光采用磁性微珠包被技術(shù)，由于磁珠體積小，可以吸附更多的抗原或抗體，同時(shí)磁珠的核心是鐵，在磁場(chǎng)中很快下沉，因此容易進(jìn)行洗滌和固相載體分離。見表 討 論： 電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性、靈敏度、精密度均優(yōu)于酶聯(lián)免疫法。 結(jié) 果： 線性：電化學(xué)發(fā)光法在 ，酶聯(lián)法在，可見電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)范圍更寬，更能充分滿足臨床要求。為進(jìn)一步了解電化學(xué)發(fā)光免疫法的特點(diǎn)，本文應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫法與酶聯(lián)免疫法對(duì)比檢測(cè) 165 份臨床血清標(biāo)本的 AFP含量， 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和比較。在本報(bào)道所列舉的6例血清中 ,有 3例 HBeAg假陽(yáng)性 ,而另 2例 HBsAg假陰性 ,說明體內(nèi)仍有 HBV復(fù)制。 討論 ： 乙型肝 炎是危害人類健康最嚴(yán)重的傳染病之一 ,而我國(guó)乙肝患者眾多 ,預(yù)防和治療負(fù)擔(dān)都很重 ,怎樣才能盡早盡快地發(fā)現(xiàn) HBV感染或攜帶者 ,是廣大臨床實(shí)驗(yàn)工作者應(yīng)予關(guān)心的問題。由于包被試劑的純度及工藝流程等的影響 ,試劑盒本身允許有一定的假陽(yáng)性 (1%～ 2%)存在 ,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)有誤差。在正常狀況下 ,HBeAg的產(chǎn)生晚于 HBsAg而消失較早。經(jīng)檢測(cè) ,在這 6例血清中 ,有 2例 RF陽(yáng)性。 分析： 筆者通過查閱文獻(xiàn) ,及時(shí)對(duì) 6例患者的臨床資料綜合分析 ,認(rèn)為以下因素可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因 : 檢測(cè)方法不夠靈敏 ,HBV的檢測(cè)方法眾多 ,而近年來的臨床實(shí)驗(yàn)室較普遍地采用 ELISA法 ,該方法要求血清中必須含一定量的 病毒顆粒 ,才可能顯示陽(yáng)性結(jié)果 ,其靈敏度與 RIA相比 ,僅是 1/20,而現(xiàn)代發(fā)展起來的分子生物學(xué)方法 ,對(duì)病毒的敏感性更是提高了數(shù)百倍。 HBeAg陽(yáng)性的臨床意義： 作為急性乙型肝炎輔助診斷和預(yù)防的重要指標(biāo) 。而我們?cè)谟?ELISA法檢測(cè) HBV五項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)記物時(shí) ,發(fā)現(xiàn) 6例 HBsAg陰性而 HBeAg陽(yáng)性的血清?？迫A試劑。但該方法簡(jiǎn)便 ,不需特殊設(shè)備 ,實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較短；成本較低 ,可有效降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) ,減輕肉體痛苦 ,三份不同標(biāo)本用同一載體 (GIFA紙片 )一次檢測(cè)即可得出 3種肝炎病毒的感 染狀況。 方法： 采用膠體金作為免疫示蹤物 ,標(biāo)記羊抗人 IgG單克隆抗體 ,將相應(yīng)的病毒抗原 HAVAg、HBcAg及 HCVAg包被在硝酸纖維素薄膜表面 ,標(biāo)本中所含抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合后 ,加入金標(biāo)記抗體 ,即可在薄膜表面形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)。 假如可以排除動(dòng)物較后期感染慢病毒和排除不同種系在一定的時(shí)間內(nèi)交叉感染，免疫缺陷病毒與靈長(zhǎng)目長(zhǎng)期協(xié)同演化的設(shè)想是有意義的，除了在各猿類種系演化的假說之外，可以肯定免１７ 疫缺陷病毒也有一個(gè)長(zhǎng)期演化過程，否則我們不可能今日在羊、馬和貓也找到免疫缺陷病毒，至于如何傳播給人類的，從譜系分析尚不能得出解釋。迄今僅在黑猩猩中發(fā)現(xiàn)一種免疫缺陷病毒，而亞洲猿猴、馬來猩猩、長(zhǎng)臂猿和獼猴則無，經(jīng)對(duì)大猩猩調(diào)查，也末得出有免疫缺陷病毒感染 的最后結(jié)論。目前所建立的試驗(yàn)，用引物可識(shí)別 HIV— 1的 A至 F亞型，有時(shí)也可顯示與 HIV— 2核酸的共同反應(yīng)性，一般 HIV— O核酸不能用 PCR法檢出，因此， PCR對(duì) HIV— O不能識(shí)別，反之，如用特異性引物，可特異的擴(kuò)增出 HIVO核酸片段，作出診斷，作 HIV— O PCR推薦選用 Cam5和 Cam3引物，可取得很好的結(jié)果?？?HIV— O與 B亞型的反應(yīng)性有的極差，可用二種方法，１６ 一是再與 HIV— O作免疫印跡試驗(yàn)，其 優(yōu)點(diǎn)是抗原具有同一性。對(duì)診斷更為重要的是那些未識(shí)別出來的含抗 HIV— O血清，按抗原夾心法建立起的試劑，對(duì)抗 HIV— O識(shí)別 甚差，原則上必須有兩個(gè)位點(diǎn)，才能顯示所要求的反應(yīng)性。當(dāng)用原病毒材料制備試劑盒時(shí)，交叉反應(yīng)特別高。在歐洲迄今很少報(bào)道 HIV— O病例，病人多與中非有關(guān)。 流行病學(xué)：加蓬的初步血清學(xué)調(diào)查報(bào)告其流行率為 3％，喀麥隆的 HIV感染中占 5％。其次，間接法采用稀釋血清加樣，降低了樣品的 HTLV特異性抗體濃度，而夾心法采用原 (或半 )倍血清加樣，提高了檢出率，增大了靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部試劑的敏感度均可達(dá)到 100%，但 3種間接法試劑均出現(xiàn)了多份假陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅在 30%左右，而北京的雙抗原夾 心法試劑則未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。 表 1 四種 ELISA試劑盒檢測(cè)抗 HTLV結(jié)果比較 北京 上海 Genelabs UBI ＋ － 合計(jì) ＋ － 合計(jì) ＋ － 合計(jì) ＋ 4 0 4 4 0 4 4 0 4 １４ － 11 782 793 4 789 793 5 788 793 合計(jì) 15 782 797 8 789 797 9 788 797 24份 ELISA抗 HTLV陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng) Western blot（ WB）確證， 4份共同陽(yáng)性的標(biāo)本為抗 HTLVⅠ陽(yáng)性，蛋白印跡帶型表現(xiàn)為： 2條 ENV帶（ GD21和 rgp462Ⅰ）及 GAG帶 (p19和 /或 p24)陽(yáng)性，其它20份標(biāo)本都無 HTLV特異反應(yīng)帶出現(xiàn)。其中只有 4份標(biāo)本四種試劑的檢測(cè)結(jié)果都為陽(yáng)性，除北京試劑外，其它三種間接酶免法試劑各出現(xiàn) 4份、 5份、 11份互不相同的陽(yáng)性標(biāo)本。 抗體確證試驗(yàn) 以 Genelabs公司的 HTLVⅠ /Ⅱ 4 種 ELISA試劑陽(yáng)性血清的 Western blot（ WB）確證。因此，在我國(guó)獻(xiàn) 血者中開展 HTLV感染的篩查已成為一個(gè)迫切需要認(rèn)真考慮的問題，其中尤以篩查試劑的選擇最為重要。 解決方法：對(duì)現(xiàn)有的標(biāo)記系統(tǒng)，包被系統(tǒng)以 及緩沖系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整。 綜上述， H5禽流感病毒的檢測(cè)方法各有利弊。其敏感度同病毒的分離鑒定相當(dāng)，有時(shí)高于用雞胚進(jìn)行的病毒分離。1984年美國(guó)賓西法尼亞州爆發(fā)禽流感時(shí) Skeeles將 IFT首次用于 AIV的檢測(cè)。 RTPCR診斷技術(shù)經(jīng)試驗(yàn)表明，可應(yīng)用于對(duì)所有亞型禽流感感染的早期快速診斷，具有敏感、特異、快速的特點(diǎn)；另外，為特異、快速地檢出可引起高致病力禽流感大爆發(fā)的 H5或 H7亞型禽流感病毒的感染，通過對(duì)比禽流感病毒血凝素基因保守序列，設(shè)計(jì)了特異性引物 ,建立了對(duì)臨床病料或雞胚接種物中 H5和 H7亞型禽流感病毒進(jìn)行快速分型檢測(cè) RTPCR診斷技術(shù)；此外， H5和 H7亞 型禽流感病毒分子分型診斷技術(shù)在特異地檢出 H5或 H7亞型禽流感病毒感染的同 時(shí)，還可根據(jù)應(yīng)用特定引物經(jīng) RTPCR擴(kuò)增出的 H5和 H7包括裂解位點(diǎn)在內(nèi)的 HA基因片段，經(jīng)測(cè)序推導(dǎo)出的氨基酸序列來判斷 H5或 H7亞型禽流感病毒的致１２ 病性高低，在為我國(guó)禽流感尤其是高致病力禽流感的防制提供先進(jìn)、有效的早期快速診斷技術(shù)和監(jiān)測(cè)手段的同時(shí)，也為高致病力禽流感防制 爭(zhēng)取到極為寶貴的快速反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)標(biāo)本 中不含流感病毒抗體或不是 H5型流感病毒抗體，不會(huì)抑制酶標(biāo)單抗與抗原的反應(yīng)。當(dāng)標(biāo)本中不含流感病毒抗原或不是 H5型流感病毒時(shí)，底物不會(huì)顯色。 我們開發(fā)了兩種試劑，分別是檢測(cè) H5型的抗原和抗體，可用于禽流感的初篩。不過，世界衛(wèi)生組織警告，如果病毒變異，后果將非常嚴(yán)重。 人類對(duì)禽流感普遍易感，老年人和兒童都有可能感染禽流感。有研究提示，它在糞便中能夠存活 105天，在羽毛中能存活 18天。 在野外條件下，禽流感病毒常從病禽的鼻腔分泌物和糞便中排出，病毒受到這些有機(jī)物的保護(hù)極大地增加了抗滅活能力。 Knipe, eds, Raven Press, 1990, ) １０ 禽流感病毒是囊膜病毒，對(duì)去污劑等脂溶劑比較敏感。禽流感病毒感染引發(fā)的疾病可能是不明顯的或是溫和的一過性的綜合征，甚至是 100%發(fā)病率和 /或死亡率的疾病。脂質(zhì)位于病毒的膜內(nèi)，大部分為磷脂，還有少量的膽固醇和糖脂。 禽流感病毒一般為球形，直徑為 80～ 120納米，但也常有同樣直徑的絲狀形態(tài)，長(zhǎng)短不一。高致病性禽流感因其傳播快、危害大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（ OIE）列為 A 類疾病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病 一、 病毒結(jié)構(gòu) 禽流感病毒基因組由 8個(gè)負(fù)鏈的單鏈 RNA片段組成。 (摘自：國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè) 2020年 1月第 25卷第 1期， P7778，高豐厚綜述，鄭佐婭審校。 不可逆變性的 AFP： AFP有天然狀態(tài)、短暫的去折疊狀態(tài)、 MGF狀態(tài)、變性狀態(tài)。蔗糖能夠穩(wěn)定 AFP的天然狀態(tài)。 AFP蛋白的構(gòu)像穩(wěn)定相對(duì)較高，這是由于 AFP含有大量的二硫鍵，同時(shí)天然配體也加強(qiáng)了 AFP 的穩(wěn)定性。 只有充分了解其結(jié)構(gòu)，才能合理解釋其功能并指導(dǎo)我們的實(shí)際工作。 AFP蛋白結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜 ,功能極其多樣。它不是自我作古、數(shù)典忘祖的、因而也不是爆炸式的罵倒一切的與充滿敵意的、而是尊重歷史、尊重前賢、尊重不同的學(xué)問與思路，接受一切合理的新舊成果與對(duì)同行對(duì)大眾充滿友善的。作為學(xué)生，應(yīng)該是日有長(zhǎng)進(jìn)、為學(xué)日益的。我把人生當(dāng)作一個(gè)學(xué)習(xí)的過程，它不是空虛的頹廢的幻滅的無意義的，而是有為的有關(guān)注有興趣有成就有意義的。它絕對(duì)不是獨(dú)斷與專橫、順我者昌、逆我者亡的，而是如切如磋、如琢如磨、春風(fēng)化雨、惠我良多的。血清 AFP水平變化是胚胎發(fā)育異常病和成人幾種病理狀態(tài)的標(biāo)志物。因此 ,有必要總結(jié) AFP的結(jié)構(gòu)、構(gòu)像特征 ,探討其功能與構(gòu)像之間的關(guān)系。在免疫應(yīng)答中，主要表現(xiàn)為抑制母體對(duì)胚胎發(fā)育的免疫應(yīng)答以及腫瘤患者對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。在部分變性狀態(tài)下與相應(yīng)的單克隆抗體有較高的親和活性。它在體內(nèi)僅占總循環(huán) AFP的 %或更少 ,但在胎兒缺陷性疾病中和 AFP的雌激 素結(jié)合的形式中， MGF增加。另一種可能的解釋是非天然狀態(tài) AFP相互結(jié)合形成二聚體，使配體不能與 AFP相互作用。世界各地的高致病性禽流感主要由 H5 和 H7 亞型禽流感病毒引起，是人畜共患病，不僅能給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性打擊，還嚴(yán)重影響人類健康?，F(xiàn)在已經(jīng)獲得了包括 H H5和 H7在內(nèi)的幾個(gè)禽流感病毒亞型 HA基因的全部序列以及所有 14個(gè)血凝素基因的部分序列。 禽流感病毒粒子大約由 ～ 的 RNA， 70%～ 75%的蛋白質(zhì)， 20%～ 24%的脂質(zhì)和 5%～ 8%的碳水化合物組成。 如圖 1 ９ H5N1型抗原的結(jié)構(gòu) 二、 禽流感病毒的致病力及毒力 禽流感病毒致病力的變化范圍很大 。 三、 禽流感病毒對(duì)理化因素的抵抗力 HA trimer. (From Fields Virology, 2nd ed, Fields amp。病毒可在加熱、極端的 pH、非等滲和干燥的條件下失活。 四、禽流感的預(yù)防 (一 ) 禽流感病毒在一定條件下可以存活較長(zhǎng)時(shí)間。 （ 3）候鳥：從韓國(guó)飛到日本越冬的候鳥有 14種之多，候鳥糞便污染水，可以引起禽流感 。世界衛(wèi)生組織及越南專家都 強(qiáng)調(diào)，目前還沒有證據(jù)顯示該病毒可以由人類傳染給人類。 五、禽流感的病原學(xué)檢測(cè) 快速診斷 金標(biāo)法 原理：膠 體金的方法是利用免疫示蹤技術(shù)的原理，將抗體或抗原包被在硝基纖維素膜上，１１ 用抗體或抗原標(biāo)記膠體金利用層吸作用，如為陽(yáng)性則發(fā)生免疫共沉淀而沉積在膜上而顯色。當(dāng)裂解的 H5型流感病毒HA抗原加到微孔后，預(yù)包被的單克隆抗體能將其捕獲，隨后加入的酶標(biāo)單抗也能與其結(jié) 合，而后通過酶催化底物顯色程度判斷結(jié)果。本試劑盒中微孔條上一次包被單克隆抗體，二次包被 H5型病毒裂解液，加入血清標(biāo)本和酶標(biāo)單抗后，標(biāo)本中的特異性抗體與酶標(biāo)單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)板上的抗原，如果加入的血清標(biāo)本能明顯抑制酶標(biāo)單抗與抗原的結(jié)合，則表明標(biāo)本中含流感病毒 H5型 HA抗原的特異性抗體。目前，我國(guó)通過設(shè)計(jì)合成 AIV核蛋白（ NP）基因特異的引物，建立了可以直接從臨床病料的感染組織中檢測(cè)所有亞型禽流感病毒的。 IFT早在 1961年就開始用于人類流感的快速診斷。 IFT用于診斷具有快速、簡(jiǎn)便、敏感性好的特點(diǎn)，而且費(fèi)用較低。但對(duì)抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對(duì)純化的病毒粒子進(jìn)行裂解。 目前存在的問題：對(duì)于咽拭樣品的特異性不好（約 91%），有待提高。 20世紀(jì) 80年代我國(guó)呂聯(lián)煌等在福建省沿海地區(qū)１３ 發(fā)現(xiàn)了一個(gè) HTLVI流行區(qū)，隨后廣東、新疆及其它一些地區(qū)都相繼發(fā)現(xiàn)了多例 HTLVI感染和HTLVI相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者。其中僅北京試劑為雙抗原夾心法，其余均為間接法試劑。