真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略(文件)
【正文】 AOX1 位點和表達(dá)質(zhì)粒中的 PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū) ,產(chǎn)生的表達(dá)菌的表型為 His+Mut。 ③ His 單位點置換。巴斯德畢赤酵母對分泌的外源蛋白的糖基化已成為研究的熱點。 影響外源基因表達(dá)的因素 ? 影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的因素主要包括 :外源基因自身的特性、外源基因整合的拷貝數(shù)、外源基因在染色體上的整合位點和方式、宿主菌的甲醇利用表型、分泌信號、產(chǎn)物穩(wěn)定性、翻譯后修飾以及培養(yǎng)條件等。在某些情況下，可通過定點突變?nèi)コ墒烨敖K止結(jié)構(gòu)域和替換稀有密碼子。 如果采用胞外表達(dá)便需要在載體中使用信號肽。 如果是前導(dǎo)肽的問題 ,就需要更換信號肽 ,如改用殺傷毒素的信號序列、菊粉酶的信號肽 ( ISP)序列。還有報導(dǎo)在目的產(chǎn)物前面加入全前導(dǎo)肽序列 (pre pro)提高了切割效率 ,從而提高分泌表達(dá)的產(chǎn)量。 宿主菌的甲醇利用表型 ? 原則上 ,如果是胞內(nèi)表達(dá) ,應(yīng)盡量用 Mut細(xì)胞 ,這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而蛋白純化更易進(jìn)行 .。 常用的方法是使用帶有抗性標(biāo)記的載體 ,通過工程菌對抗生素的耐受力的不同來進(jìn)行多拷貝篩選 ,耐受抗生素濃度越高意味攜帶的拷貝越多 。 ? 然而也有不少實驗表明 ,拷貝數(shù)越多并不一定意味表達(dá)量越大 ,如果要確定多拷貝策略對提高特定目的基因產(chǎn)量是否有效 ,需要同時篩選出單拷貝載體與多拷貝載體并對兩者進(jìn)行產(chǎn)量對比才能得到影響結(jié)果。 個別情況下拷貝數(shù)增加對產(chǎn)量也會產(chǎn)生負(fù)效應(yīng) ,原因可能在于過高表達(dá)會對分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反饋抑制 。 . 韋宇拓等利用菊粉酶的信號肽序列來構(gòu)建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達(dá)了 B2葡聚糖酶 ,結(jié)果表明ISP 信號肽序列分泌效率不低于利用 α因子 ? 信號肽的表達(dá)載體 pPIC9 K。 由于畢赤酵母可以高密度培養(yǎng) ,外源蛋白對酵母沒有特別影響時通常酵母密度越大蛋白分泌量越大 ,因此一般使用 Mut+型的轉(zhuǎn)化子 ,這樣在甲醇的誘導(dǎo)下也能利用甲醇來增殖 。 大量的資料表明誘導(dǎo)時間在 3 d～ 5 d之間最好 ,時間再長對蛋白的表達(dá)通常沒有什么幫助 ,因為前期分泌出來的蛋白有被降解的可能 。 在發(fā)酵罐大規(guī)模生產(chǎn)時 ,蛋白降解的影響更為嚴(yán)重 ,常需要采取不同的方法防止外源蛋白降解 。 此外調(diào)整培養(yǎng)基的配料如氮源 、 在添加甲醇前徹底去除甘油以減少表達(dá)抑制 、 糖基化的優(yōu)化等措施都有相應(yīng)例子實現(xiàn)蛋白產(chǎn)量的提高 。在培養(yǎng)基中添加蛋白胨或者酪蛋白水解產(chǎn)物來抑制水解 。 雖然酵母的菌體密度越大越好 ,表達(dá)量也相應(yīng)的有一定提高 ,這也是畢赤酵母的突出優(yōu)點 ,但菌體的密度同時會受到供氧和營養(yǎng)供給及蛋白降解等限制 ,需要通過實驗來進(jìn)行優(yōu)化 。 誘導(dǎo)表達(dá)時甲醇的用量為發(fā)酵液總體積的 %～ 3%之間 ,甲醇濃度太高將會產(chǎn)生毒性 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個表型 ,其中 Mut+能夠快速利用甲醇 ,MutS利用得慢 ,Mut不能利用甲醇生長 。 分泌信號 ? 不適合的信號肽可導(dǎo)致信號肽加工不完全 ,或者蛋白分泌水平低 ,甚至不能分泌 。 基因劑量 ? 一般來說 ,高拷貝整合可以提高表達(dá)量 , 如 Jeffrey 等發(fā)現(xiàn) , 重組 CD40L 的最高產(chǎn)量是在有 8 個以上拷貝的菌株中獲得。此外還可以使用攜帶多拷貝表達(dá)盒的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子。 Doring 等研究表明 ,在生產(chǎn)哺乳動物膜轉(zhuǎn)運蛋白時 ,pGAP 比 pAOX1 更理想。 整合性載體的表達(dá)盒穩(wěn)定 ,可以多位點整合而獲得多拷貝以及進(jìn)行不同整合方式 。α因子信號序列的切割位點 Kex2在 AGA和 GAG之間 ,如果表達(dá)的蛋白要求維持 N端的天然序列 ,需要在 AGA后面直接插入目的基因 。目前研究發(fā)現(xiàn) α因子信號序列的分泌能力在很多例子中比其他前導(dǎo)肽強(qiáng) ,而且其他一些前導(dǎo)肽 (如 PHO1)只能分泌到膜周質(zhì) ,存在缺陷 ,而 外源基因自帶的信號肽一般在畢赤酵母中表達(dá)效率很低甚至不分泌。 載體的構(gòu)建 ? 通過選擇添加前導(dǎo)肽 ,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內(nèi)表達(dá)也可以分泌到胞外。 特定的（ A+T）富含區(qū) 可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號
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