真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略(文件)
【正文】 AOX1 位點和表達質粒中的 PAOX1及轉錄終止區(qū) ,產生的表達菌的表型為 His+Mut。 ③ His 單位點置換。巴斯德畢赤酵母對分泌的外源蛋白的糖基化已成為研究的熱點。 影響外源基因表達的因素 ? 影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達的因素主要包括 :外源基因自身的特性、外源基因整合的拷貝數(shù)、外源基因在染色體上的整合位點和方式、宿主菌的甲醇利用表型、分泌信號、產物穩(wěn)定性、翻譯后修飾以及培養(yǎng)條件等。在某些情況下，可通過定點突變去除成熟前終止結構域和替換稀有密碼子。 如果采用胞外表達便需要在載體中使用信號肽。 如果是前導肽的問題 ,就需要更換信號肽 ,如改用殺傷毒素的信號序列、菊粉酶的信號肽 ( ISP)序列。還有報導在目的產物前面加入全前導肽序列 (pre pro)提高了切割效率 ,從而提高分泌表達的產量。 宿主菌的甲醇利用表型 ? 原則上 ,如果是胞內表達 ,應盡量用 Mut細胞 ,這樣得到的蛋白產物中醇氧化酶蛋白量較少而蛋白純化更易進行 .。 常用的方法是使用帶有抗性標記的載體 ,通過工程菌對抗生素的耐受力的不同來進行多拷貝篩選 ,耐受抗生素濃度越高意味攜帶的拷貝越多 。 ? 然而也有不少實驗表明 ,拷貝數(shù)越多并不一定意味表達量越大 ,如果要確定多拷貝策略對提高特定目的基因產量是否有效 ,需要同時篩選出單拷貝載體與多拷貝載體并對兩者進行產量對比才能得到影響結果。 個別情況下拷貝數(shù)增加對產量也會產生負效應 ,原因可能在于過高表達會對分泌途徑產生負反饋抑制 。 . 韋宇拓等利用菊粉酶的信號肽序列來構建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達了 B2葡聚糖酶 ,結果表明ISP 信號肽序列分泌效率不低于利用 α因子 ? 信號肽的表達載體 pPIC9 K。 由于畢赤酵母可以高密度培養(yǎng) ,外源蛋白對酵母沒有特別影響時通常酵母密度越大蛋白分泌量越大 ,因此一般使用 Mut+型的轉化子 ,這樣在甲醇的誘導下也能利用甲醇來增殖 。 大量的資料表明誘導時間在 3 d～ 5 d之間最好 ,時間再長對蛋白的表達通常沒有什么幫助 ,因為前期分泌出來的蛋白有被降解的可能 。 在發(fā)酵罐大規(guī)模生產時 ,蛋白降解的影響更為嚴重 ,常需要采取不同的方法防止外源蛋白降解 。 此外調整培養(yǎng)基的配料如氮源 、 在添加甲醇前徹底去除甘油以減少表達抑制 、 糖基化的優(yōu)化等措施都有相應例子實現(xiàn)蛋白產量的提高 。在培養(yǎng)基中添加蛋白胨或者酪蛋白水解產物來抑制水解 。 雖然酵母的菌體密度越大越好 ,表達量也相應的有一定提高 ,這也是畢赤酵母的突出優(yōu)點 ,但菌體的密度同時會受到供氧和營養(yǎng)供給及蛋白降解等限制 ,需要通過實驗來進行優(yōu)化 。 誘導表達時甲醇的用量為發(fā)酵液總體積的 %～ 3%之間 ,甲醇濃度太高將會產生毒性 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個表型 ,其中 Mut+能夠快速利用甲醇 ,MutS利用得慢 ,Mut不能利用甲醇生長 。 分泌信號 ? 不適合的信號肽可導致信號肽加工不完全 ,或者蛋白分泌水平低 ,甚至不能分泌 。 基因劑量 ? 一般來說 ,高拷貝整合可以提高表達量 , 如 Jeffrey 等發(fā)現(xiàn) , 重組 CD40L 的最高產量是在有 8 個以上拷貝的菌株中獲得。此外還可以使用攜帶多拷貝表達盒的載體進行轉化來獲得多拷貝轉化子。 Doring 等研究表明 ,在生產哺乳動物膜轉運蛋白時 ,pGAP 比 pAOX1 更理想。 整合性載體的表達盒穩(wěn)定 ,可以多位點整合而獲得多拷貝以及進行不同整合方式 。α因子信號序列的切割位點 Kex2在 AGA和 GAG之間 ,如果表達的蛋白要求維持 N端的天然序列 ,需要在 AGA后面直接插入目的基因 。目前研究發(fā)現(xiàn) α因子信號序列的分泌能力在很多例子中比其他前導肽強 ,而且其他一些前導肽 (如 PHO1)只能分泌到膜周質 ,存在缺陷 ,而 外源基因自帶的信號肽一般在畢赤酵母中表達效率很低甚至不分泌。 載體的構建 ? 通過選擇添加前導肽 ,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內表達也可以分泌到胞外。 特定的（ A+T）富含區(qū) 可作為多腺苷酸或轉錄終止信號
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