真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略-wenkub.com
2025-02-18 04:33 本頁(yè)面
【正文】 利用酵母可以在較寬的 pH下生長(zhǎng)的特點(diǎn)嘗試調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液的 pH以抑制水解 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá) ,外源蛋白有可能被降解 。 可以采取一定時(shí)間內(nèi)補(bǔ)加甲醇的措施 ,彌補(bǔ)消耗掉的甲醇 。表型的選擇一般由需要表達(dá)的蛋白而決定 。 嘗試不同的信號(hào)肽 ,對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行突變改造或人工全合成信號(hào)肽等策略可用于實(shí)現(xiàn)信號(hào)肽正確加工和提高分泌水平 。但許多實(shí)例表明 ,含單拷貝表達(dá)框的宿主菌足以得到最佳產(chǎn)量。國(guó)外也有報(bào)導(dǎo)在大腸桿菌引入轉(zhuǎn)座子 ,在大腸桿菌階段利用抗生素濃度篩選攜帶多拷貝目的基因的質(zhì)粒。 多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選 ? 通常增多轉(zhuǎn)化子攜帶外源基因的拷貝數(shù)能夠在一定程度上提高表達(dá)量 ,因此篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子來(lái)提高產(chǎn)量是一個(gè)簡(jiǎn)單容易實(shí)施的策略。 AOX1和組氨酸脫氫酶( HIS4) 基因位點(diǎn)都已被成功用于表達(dá)外源蛋白 . Sreekrishna 等認(rèn)為 ,由于表達(dá)框中 his4染色體突變拷貝與完好的 his4 基因能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)換 ,所以 首選 Aox1位點(diǎn)作為整合位點(diǎn) 。有報(bào)道表明 AGA后面的蛋白序列會(huì)對(duì) α因子信號(hào)序列的切割有影響 ,并且某些表達(dá)蛋白也會(huì)保護(hù)自身免受某些切割反應(yīng) ,通常當(dāng) Kex2位點(diǎn)后面的氨基酸殘基比較小時(shí) ,對(duì)切割的影響不大。 載體的構(gòu)建 ? 但如果使用 α因子時(shí)蛋白得不到表達(dá) ,應(yīng)裂菌后再次檢測(cè)目的蛋白。 由于有些蛋白在胞內(nèi)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性 ,或者因?yàn)楫a(chǎn)物濃度高引發(fā)細(xì)胞一些自發(fā)的調(diào)節(jié)抑制表達(dá) ,所以 一般先嘗試胞外分泌表達(dá) , 同時(shí)可以減少下游的純化工序。 某些稀有密碼子，尤其是稀有密碼子密集區(qū)往往成為制約翻譯速率的因素 。 ②糖鏈中不含具有潛在致敏作用的?1,3甘露糖 。 重組蛋白翻譯后修飾 ? Pichia pastoris 能進(jìn)行與高等真核細(xì)胞相似的許多翻譯后修飾 ,包括二硫鍵形成、信號(hào)序列加工、折疊、 O連接和 N連接糖基化 等。產(chǎn)生的表型是 His+Mut+。 轉(zhuǎn)化時(shí) ,載體 DNA 必須切成線狀才能與染色體進(jìn)行同源重組 ,將整個(gè)載體連同外源基因整入宿主染色體 . 通常有以下幾種整合方式 : ① 雙位點(diǎn)互換。如 p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZα,p GAPZα。 酶切割位點(diǎn)周圍氨基酸序列及外源蛋白的 3 級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響信號(hào)肽的加工效率。 畢赤酵母表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記 ? 選擇標(biāo)記一般為對(duì)應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因 , 常用 his4 , 也可用來(lái)源于釀酒酵母的 arg4基因和 suc2基因 . kanr基因和Shbler 基因（ Zeocin抗性基因）也能夠作為細(xì)菌和酵母菌的選擇標(biāo)記，并且攜帶這兩個(gè)標(biāo)記的表達(dá)載體較其他表達(dá)載體更易于篩選。 以甲醇為碳源生長(zhǎng)時(shí) ,約 5%的 mRNA由 AOX1 基因轉(zhuǎn)錄。 胞內(nèi)表達(dá)的載體有 pPIC pPIC3K、 pHILD pPICZA、 pPICZAB和 pPICZAC等； 分泌表達(dá)的載體有 pPIC pPIC9K、 pACO81 pPICZαA（ B、 C）和 pHILS1等 。 一般說(shuō)來(lái) ,蛋白胞內(nèi)表達(dá)時(shí) ,優(yōu)先考慮用 Muts 表型 ,對(duì)于分泌表達(dá) ,Mut+和 Muts都可使用 。 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 巴斯德畢赤酵母菌株： ? 一 般 用 于 外 源 基 因 表 達(dá) 的 Pichia pastoris 菌株有Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X33， KM71 , SMD1168等 . 根據(jù)利用甲醇的能力 , 可將巴斯德畢赤酵母分為 3 型 : ① Mut + 型為甲醇快利用型 , 此型畢赤酵母具有完整的 AOX1 和 AOX2 基因 , 絕大多數(shù)畢赤酵母為 Mut + 表型 。 ? (3) 可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行類似真核的加工折疊和翻譯后修 ? 飾 ,產(chǎn)物從而具有天然蛋白的活性 。 鹽藻作為一種新型的生物反應(yīng)器 ,目前還不能真正生產(chǎn)外源性物質(zhì)。 鹽藻作為新型的真核生物反應(yīng)器，除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟(jì)廉價(jià)、簡(jiǎn)單有效、安全可靠等特點(diǎn) 。同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的 2% 10% ,
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