第十章核酸分子雜交技術(shù)(文件)
【正文】 四、探針的純化 乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀 DNA片段，可去除 dNTP和蛋白質(zhì) 凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子 DNA和小分子 dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（ 80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是 Sephadex G50 微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針 。另一單鏈 DNA模板同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的 DNA鏈。 （五） Southern雜交 預(yù)雜交：封閉膜上能與 DNA結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含 DNA探針的雜交液 雜交：液相中的 DNA探針與膜上的待測 DNA雜交 雙鏈 DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA （六）雜交結(jié)果檢測 放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針 比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針 （七） Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 酶切圖譜分析 特定基因定性和定量 基因突變分析 限制性片段長度多態(tài)性的分析 二、 Northern印跡雜交 基本原理和基本過程與 Southern blot基本相同 鑒別 RNA 探針可用 DNA或 RNA片段 待測樣品為總 RNA或 mRNA Northern印跡與 Southern 印跡的不同點(diǎn) 變性： RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保 持 RNA處于變性狀態(tài)， DNA電泳前和電泳 中不變性 轉(zhuǎn)膜： RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理 ,Southern 印跡時(shí)， DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理 靶核酸為 RNA 三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 斑點(diǎn)印跡為圓形 狹縫印跡為線狀 鑒別 DNA、 RNA 簡單、快速，同一張膜可檢測多個(gè)樣品 特異性不高、不能鑒別核酸分子量 四、原位雜交 定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。如鮭精 DNA或小牛胸腺 DNA， Denharts溶液或脫脂奶粉 第二節(jié) 核酸分子雜交的方法 按待測核酸是否固定在固相支持物上分： ? 固 液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 ? 液相雜交 RNA酶保護(hù)分析法 核酸酶 S1保護(hù)分析法 一、 Southern印跡雜交 （一）待測核酸樣品的制備 裂解或破碎細(xì)胞 抽取純化基因組 DNA 限制酶消化 DNA為大小不同的 DNA片段 （二）待測 DNA樣品的電泳分離 瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠
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