核酸提取及常見問題分析(文件)
【正文】 DS、異硫氰酸胍等） ? 高鹽洗滌 ? 蛋白酶處理 ?多糖的去除： ? 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2體積的 5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 核酸分離、純化 ?多酚的去除： ? 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： β 巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 ? 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如 PVP、 PEG(聚乙二醇 )，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與 DNA的結(jié)合 核酸分離、純化 ?鹽離子的去除： ? 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解 ? 當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分 ? 沉淀時加入 1/10體積的 NaAc（ ， 3M），有利于充分沉淀 ? 沉淀后應(yīng)用 70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 ? 晾干 DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） ? 若長期儲存建議使用 TE緩沖液溶解 ? TE中的 EDTA能螯和 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase ? pH值為 ，可防止 DNA發(fā)生酸解 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì) 2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) 3. DNA中殘留有金屬離子 1. 重新純化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前） 2. 重新沉淀 DNA，讓酒精充分揮發(fā) 3. 增加 70％乙醇洗滌的次數(shù)（ 23次） DNA提取常見問題 ?問題一： DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng)。 提取的通用方法? 異硫氰酸胍 /苯酚法 ? 步驟 : ? 材料準(zhǔn)備： 盡量新鮮。苯酚 /氯仿可抽提去除雜物。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀 RNA。 影響 RNA提取的因素 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 RNA提取常見問題 ? RNA 的降解 ? OD260 /OD280 比值偏低 ? 電泳帶型異常 ? 下游實驗效果不佳 RNA降解 ? 新鮮細(xì)胞或組織： ? 裂解液的質(zhì)量 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液的用量不足 ? 組織裂解不充分 ? 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟 ， 胸腺等 )， 很難避免 RNA 的降解 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質(zhì)污染： ? 不要吸入中間層及有機(jī)相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 抽提試劑殘留： ? 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA， 并且徹底去掉 75% 乙醇 。 ? 用水稀釋樣品： ? 測 OD 時 ， 對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris， pH 。 下游實驗效果不佳 ? RNA 降解 ? 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 ? 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 ? DNA 污染 使用 RNaseFree 的 DNase I 消化抽提 RNA RT常見問題分析和解決方案 問題一： 少量或沒有 RTPCR產(chǎn)物 RNA降解 分離無污染，高質(zhì)量的 RNA；防止 RNA降解 RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 70％（ v/v）乙醇清洗 RNA沉淀，除去抑制劑 起始 RNA量太低 增加 RNA的量 多糖同 RNA共沉淀 用氯化鋰沉淀 RNA以除去多糖 合成 cDNA第一鏈合成的引物退火失敗 確定退火溫度適合所用的引物 RNA模板存在較多二級結(jié)構(gòu) 將 RNA和
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