【正文】 07等。加入適當(dāng)?shù)氖删w RNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。 ① 結(jié)構(gòu) pUC的質(zhì)粒部分、 fi噬菌體 ori、 Kanr和 Ampr抗性。 133 134 pCR1000 135 Promega 公司的 T載體系列 pGEMT vector 136 pTarget vector G418抗性 可在真核生物表達(dá) 外顯子捕捉 137 T vector的克隆過程 ——簡便！ T vector PCR product T4 DNA ligase T T138 7. 噬菌體展示載體（ Phage display vector） （ 1）噬菌體展示（ Phage display） 將外源蛋白（多肽、酶、抗體、 DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于 噬菌體的外表面 。 啟動子 外源 DNA M13基因 Ⅲ ori M13 display vector 外源多肽 141 四、雙鏈?zhǔn)删w載體 — ?載體 （ 1）長度為 48502 bp； （ 2）雙鏈線性 DNA； （ 3）但在兩端有 cos位點，可以環(huán)化。 其他約 1/3是 非必須基因（ 位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。 形成多聯(lián)體 ?DAN分子。 EcoR I cI ?gt10 155 插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物， ??載體 DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。（其上含有一個 EcoR I 克隆位點）。 可置換區(qū) MCS MCS 如： ? EMBL Charon40等。 在克隆的時候，可以用 Hae I 酶進一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。 5. ?載體的體外包裝 在試管中與 ?噬菌體的 頭部 和 尾部 蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組 DNA注入受體菌中。 （ 3）體外包裝存在的問題： ① 包裝錯誤： 既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的 內(nèi)源性原?DNA，也能包裝 重組的 ?DNA載體 。 169 比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。 在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化 DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌 ）。 51kb5kb=45kb 177 （ 4）部分 cosmid vector Cosmid 載體 復(fù)制子 大?。?kb) 選擇標(biāo)記 克隆位點 克隆能力（ kb) c2XB pMB1 Ampr, Kanr BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaI 32~45 pHC79 pMB1 Ampr , Tetr EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, PstI, CalI 29~46 pHS262 ColE1 Kanr BamHI, EcoRI, HincII 34~50 pJC74 ColE1 Ampr EcoRI, BamHI, BglII, SalI 21~37 pJC7558 ColE1 Ampr EcoRI, BamHI, BglII 16~42 pJC74m ColE1 21 Ampr, Kanr BamHI 16~32 pJC720 ColE1 Elimm, Rifr HindIII, XmaI 11~28 178 Cosmid 載體 復(fù)制子 大小（ kb) 選擇標(biāo)記 克隆位點 克隆能力（ kb) pJC81 pMB1 Ampr, Tetr KpnI,BamHI,HindIII,SalI 30~46 pJB8 ColE1 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31~47 MuA3 pMB1 Tetr PstI,EcoRI,BalI,PvuI, PvuII 32~48 MuA10 pMB1 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuI 32~48 pTL5 pMB1 Tetr BglII,BalI,HpaI 31~47 pMF7 pMB1 Ampr EcoRI,SalI 32~48 179 應(yīng)用 cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組 DNA技術(shù)，叫 “ 柯斯克隆 ” （ cosmid cloning）。 兩個 cos位點之間，必須保持 38—45kb的 DNA， Ter體系才能識別。 ③ 連接 182 切割 合適長度 的雜種 DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。 ③ 多個本來不在一起的外源 DNA片斷連接起來同時插入載體。 （ yeast artificial chromosome, YAC) （ 2）克隆容量大，為 230kb1700kb。 （ 2）端粒（ TEL） 人是 TTAGGG重復(fù)序列 。 196 TRP URA3（分別位于兩臂）。 二、細(xì)菌人工染色體（ BAC） 1. F質(zhì)粒的特點： 每細(xì)胞只有一個拷貝，不會重組。 （ 3）比較穩(wěn)定。 （ 4） loxP是 P1 Cre蛋白作用位點。 兩個相同的 RNA分子在 5’端附近經(jīng)氫鍵連接形成 70S RNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)節(jié)作用。 LTR本身還具有啟動子和 polyA加尾信號的功能。 gag：核心蛋白。 （ 3）外源基因和啟動子插入到 ?+下游。 （ 2）宿主范圍廣 2. 腺病毒的 優(yōu)點 不僅能感染有分裂能力的細(xì)胞，也能感染不能分裂的細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）。 （ 3）可以在呼吸道和腸道中繁殖， 可以通過口服或噴霧的方式感染。 E1或 E3缺失病毒。 質(zhì)粒與病毒DNA（缺失E1或 E3） 215 216 217 第五節(jié) 基因打靶載體（ Targeting vector） 通過 DNA同源重組，使細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失或在基因組特定的位點插入外源基因。 定點整合 219 1. 兩段同源 DNA序列（ HB1和 HB2） 2. 目的基因 三、基因打靶載體組成 3. 編碼抗 G418的基因（ neor） 4. 胸苷激酶基因（ HSVtk1和 HSVtk2） 與靶位點兩端的區(qū)域同源 新霉素（ neomycin）磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 分別來自 I型和 II型單純皰疹病毒（ HSV）。 細(xì)胞在 G418中存活 。 表達(dá)胸苷激酶（ tk）的細(xì)胞都被殺死（ Tk能把 GCV轉(zhuǎn)化成有毒的化合物 ）。 沒有整合進 neor基因的細(xì)胞都被殺死。細(xì)胞被 tk基因殺死 。 2. 整合的位置盡量選在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方。 在同源序列之間插入外源基因和選擇標(biāo)記基因。 （ 1）腺病毒載體的構(gòu)建 用 同源重組 的方法插入外源基因。 （ 5）腺病毒容易制備、純化。 共同特點是都帶有倒置的末端重復(fù)（ ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。 209 3. 反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建 （ 1）刪除 pol、 env和 gag基因。 env：外殼蛋白。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。 （ 6）兩側(cè)的 NotI可用于切下外源 DNA。 （ 2） parA和 parB維持低水平質(zhì)?？截悢?shù)。 像提取質(zhì)粒一樣直接提純。 （ 2）選擇方式 5. YAC轉(zhuǎn)化過程 trp 和 ura cen ura3 trp1 200 201 （ 1）存在插入子的穩(wěn)定性問題 6. YAC的缺點： （ 2）同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個 YAC引起交換 （ 3）轉(zhuǎn)化效率低 （ 4）難以制備純的 YACDNA 202 H. Shizuya等 1992年在大腸桿菌 F因子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 （真核生物中只有酵母菌有 ARS） 195 位于 SUP4 基因內(nèi)部。 190 （ 1） DNA復(fù)制起始點（ ori） 2. 染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個端粒（ telomeres， tel） 191 （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的組成結(jié)構(gòu) 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 7886bp I II III 由三個區(qū)組成 193 酵母第 11號染色體的著絲粒區(qū)序列： 194 酵母 端粒保守序列 是 (G4T2)n 重復(fù)序列。 克服載體自體連接的改良方案： 189 第三節(jié) 大分子 DNA克隆載體 1983年形成基礎(chǔ)理論 , 1987年變?yōu)楝F(xiàn)實。 ⑤ 感染大腸桿菌 ④ Ter體系識別并切割 183 184 185 Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone 186 187 大質(zhì)粒！ 188 ① 載體片斷自我連接。 （ 6） cosmid克隆的一般過程 ② 用同樣的內(nèi)切酶消化 cosmid載體。 “多聯(lián)體 ” 復(fù)制： 包裝識別。 176 有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。 Sau3A BamHI 170 171 噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑 172 1978年 J. Collins和 B. Hohn等人發(fā)展出 cosmid vector（ cos sitecarrying plasmid) ? DNA： 4—6kb （ 1）大小 （ 2）組成 6. cosmid載體（粘粒） cos序列和控制包裝的的序列。 既不能超過正常野生型容量的 105%； 又不能低于正常野生型容量的 75% 野生型 ?DNA的必須區(qū)是 28kb，所以 ?載體的最大克隆容量是 23kb。 （ 2）體外包裝過程 ① ?噬菌體外殼蛋白的合成 E 基因 ?的 E 基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的 70%）。 （ 4） ?載體的篩選標(biāo)記 ② 插入型載體 根據(jù)插入所引起的表型突變。 以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。 LacZ’ EcoR I Charon16A 選擇標(biāo)記 : 157 ② 替換型載體（ substitution vectors) ? 兩個多克隆位點區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于 ?DNA的非必須區(qū)兩端。 選擇標(biāo)記 : 如 ?NM1149載體的兩個克隆位點（ EcoR I 和 Hind III）都是位于 cI基因內(nèi)部。 153 （ 1）構(gòu)建原理： 4. ?噬菌體載體的構(gòu)建 （ 2）構(gòu)建過程 ① 在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點 ② 引進某些突變表型，作為選擇標(biāo)記 ③ 突變某些基因，使它成為安全載體 ④ 刪除 ?DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點 ?噬菌體 DNA上本身有 5個 EcoR I 和 7 個Hind III切點！ 刪除 ?噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。 λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 147 DNA Protein coat cos cos Nonessential region Long (left) arm short (right) arm Exogenous DNA (~2023 kb) λ phage 12bp 148 ? genome(48502bp) 149 150 ?噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進行 ?型復(fù)制。 1. ?DNA分子的特點 cos位點（ cohensiveend site）： 142 λ phage kb in length ?Linear or circular genome (cos ends) 溶菌階段 (復(fù)制和釋放 ) 溶源階段 (整合到寄主染色體上 ) 143 ?DNA進入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（ RF DNA）。 絲